JAK%2fSTAT、PKA和ERK信号通路对TLR诱导中性粒细胞生存影响及Bak蛋白表达的研究.pdfVIP

摘 要 目的：中性粒细胞(polymorphonuclear 炎症细胞，它具有终末分化特性，一旦分化成熟，便启动其自发性凋亡程序， 这一机制在促进炎症的无损伤收敛和维持机体内环境的稳定中发挥重要作 用。中性粒细胞通过抗体或补体的调理作用启动活化，也能直接利用Toll样 受体(Toll．1ike 然免疫系统中特异的I．型跨膜受体及病原模式识别受体。TLR能特异的识别 molecular 病原体相关分子模式(pathogen．associated 体抵御病原微生物的第一道防线，在固有免疫中发挥重要作用，而且还能调 节获得性免疫，是连接固有免疫与获得性免疫的桥梁。作为重要受体的TLR 能诱导中性粒细胞的生存与活化，在急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋 亡中起着关键作用。近期研究表明，TLR信号转导级联的激活有助于清除病 原物的免疫应答，提高中性粒细胞的免疫效应。TLR可激活核转录因子 (nuclear protein 信号转导通路，但是仍存在其它牵涉到调节中性粒细胞生命周期的信号通路。 为进一步研究有关TLR诱导中性粒细胞凋亡抑制的信号转导分子机制，本实 activated transducerandactivatorof 验将探讨JAK／STAT(januskinase／signal kinase A)和ERK(extracellular transcription)，PKA(protein proteinkinase)通路在中性粒细胞中的调控作用。通过研究，从信号转导水平 探索TLR诱发的中性粒细胞生存与正常中性粒细胞生存的不同分子调控机 制，从而为TLR配体刺激下中性粒细胞是否有新的调控通路的确立提供实验 l 室依据。此外，中性粒细胞中Bcl．2家族蛋白的存在和作用与其它细胞相比有 较大的差异性，它们在调节中性粒细胞生存方面也具有非常重要的作用。目 前还很少报道有关Bcl．2家族对TLR作用于中性粒细胞功能的影响。本实验 探索TLR配体刺激下中性粒细胞内Bak(Bcl-2 homologous 蛋白表达水平，将为调控中性粒细胞生存影响因素提供新的实验室依据。方 法：Ficoll密度梯度法分离、纯化健康人外周静脉血中性粒细胞；台盼兰拒染 度。将中性粒细胞与TLR配体共同培养8 h，利用流式细胞术(flowcytometry， 下培养lh后再与TLR配体共同培养8 ERK通路和自发性凋亡的细胞模型。流式细胞术检测、分析、对比抑制信号 转导通路的细胞死亡和自发性凋亡的凋亡率。将中性粒细胞与TLR配体共同 体通过Western 型中的表达，从而分析凋亡蛋白活化状态及TLR刺激Bcl．2家族蛋白的调节 作用。结果：1．光镜显示：新鲜分离、纯化的中性粒细胞活性和纯度均96％； 2．运用流式细胞术对中性粒细胞自发性凋亡和药物刺激组进行AnnexinV和 PI双染色检测凋亡率，发现未经处理的中性粒细胞经过8h培养，其自发性凋 亡的发生率为24．35％，而中性粒细胞经TLR配体刺激后，凋亡率与自发性凋 亡组比较有明显的差异性(P0．05)。3．流式细胞术检测信号通路抑制剂对 TLR诱导中性粒细胞的凋亡率。结果显示：相对于空白对照组，激酶抑制剂 中性粒细胞作用时并没有改变中性粒细胞的凋亡率；而AG490能减少PGN 存有相似的抑制效应。4．培养2h和8h后，将各模型组中的中性粒细胞裂解， 抽提总蛋白进行SDS．PAGE并相互比较。结果显示，在不同刺激物的刺激下， 中性粒细胞蛋白质表达的性质和数量发生了不同程度的改变。5．TLR配体刺 h、1h、2h、4h、8 激中性粒细胞0 h后，提取蛋白并用Westernblotting技 术检测比较Bak蛋白的表达。结果显