第四章第五节酶的放射分析.pptVIP

第五节 酶的放射分析（Radiometric Method of Enzyme Assay） 定义:用放射性核素标记酶底物进行酶的活力测定的方法，称为酶的放射分析 (Radiometric Method of Enzyme Assay)。 已知有六类，数百种酶可用这种方法测定活力 与生物化学测定法比较：更灵敏、更特异。 一、基本原理和特点 目的：测定酶活力 酶活力 实质上是测定酶催化反应的速率 该速率以浓度/时间表达 指单位时间内底物的消耗量或产物的生成量（通常多用后者） 该速率越大，酶活力越强 酶活力大小用酶活力单位表示。 酶活力单位： ①新国际制单位Katal（Kat）： 1 Kat指在规定条件下，每秒钟酶催化1mol底物转变所需的酶量。 Kat与U的数学关系 1Kat=1mol/秒 1U=16.67nKat 由酶活力单位可引伸出： 酶活性浓度（ Kat/L ） 酶的比活力（ kat/g酶蛋白或Kat/g总蛋白），一般用μmol/min/mg蛋白表示 比活力越高，酶的纯度越高 酶的活力受底物和酶浓度制约 与反应系统、反应条件等关系密切 评价酶活力时，应指明所规定的条件。 酶对底物的催化反应可用下式表示: *S+E?E*S→E*P→E+*P E：代表酶 *S：酶的标记底物 E*S是酶与底物形成的中间物 E*P：酶与产物的复合物 *P：底物经酶催化转变的产物 在反应中酶的量不变 随着反应时间的延长 酶可将全部底物转化为产物 因此，要限定反应时间，不待底物消耗完就将产物分离并测定其放射性，用下式表达酶的活力： 与生物化学方法比较，最突出的特点： ①灵敏度高 灵敏度比传统的方法高1-3个数量级 酶催化1 pmol3H标记底物生成的产物放射性可达 104数量级 很少量酶液样品中的酶活力即可测出 能在较宽的底物浓度范围内进行酶促反应，有利于酶的米氏常数Km的测定 有利于竞争性抑制剂的作用研究 在底物浓度很低时，竞争抑制剂的作用更能明显地显示 还可以对酶样品作多倍稀释后使用，酶样品中存在的干扰物也随稀释而减少，对酶促反应的干扰亦随之减轻。 ②特异性强 酶的催化反应对外加底物和内源性底物无差异 常用的酶活力测定法，对产物测定所使用的光谱分析法（紫外分光光度法、荧光测定法、比色法等）都不能区分外加底物的酶催化反应产物与内源性底物的产物 样品中存在的其他内源性物质或药物也可能对光谱产生干扰 酶的放射分析法是外加标记底物，测定产物的放射性 因此，只有由标记底物转化的放射性产物才被测出，很容易将内源性底物转化的非放射性产物区分开 不受其他内源性物质及药物干扰 酶的放射分析的这种特异性更适合于分析粗酶提取液中的酶活力以及研究酶的激动剂、抑制剂、反应条件（pH等）改变对酶活力的影响 在方法学上同样能精简某些分离纯化步骤。 二、酶的放射分析基本方法 酶液制备 ↓ 酶促反应 ↓ 终止反应 ↓ 产物与未转化的底物分离 ↓ 产物的放射性测量 ↓ 计算酶活力 三、利用酶促反应的其他放射分析法 在酶的放射分析原理基础上,将实验设计加以调整或将标记底物直接引入体内: 形成了放射酶促分析法（Radioenzymatic assay） 和整体酶活力测定法。 1．放射酶促分析法 （1）酶促同位素衍生物法（Enzymatic isotope deriva- tive method） 通过特异酶的作用，使已知比活度的标记试剂与待测生物活性物质形成标记产物（即衍生物）。该产物的放射性除以标记试剂的比活度即可计算出待测物的量 准确定量须满足以下条件： 衍生物的生成速率需与底物浓度成正比 反应100％完成 衍生物能100％回收 放射化学纯度高 衍生物不发生分解 完全满足这些条件困难很多，产物100％回收十分困难，所以，直接实验结果不能代表客观实际，需要对计算结果进行复杂的校正 酶促双同位素衍生物技术（Enzymatic double-Isotope derivate method） 可以克服上述缺点 分析样品中先加入微量高比活度的标记物作为回收指示剂（Recovery tracer） 再加入另一种核素标记物作为衍生物试剂 经酶作用后生成双标记衍生物（两种核素的射线不同种，或能量相差很大） 计算产物中回收指示剂的回收率，进行校正 解决产物无法100％回收问题。 （2）酶的激动剂和抑制剂测定法（Measurement of enzyme activators and inhibitors） 基础为反应速率： 酶的激动剂在反应液中的浓度增加，反应速度加快 反应速度随抑制剂浓度增加而减少 酶促反应速率以产物的放射量来衡量 用系列浓度的酶激活剂（或抑制剂）与定量的酶制剂进行定时反应 分离