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材料物理性能及测试课程教师:杨志懋班级:硕6066学号:3116029007日期:2016年11月18日冷冻电镜显微技术在生物大分子的三维结构研究中的应用自科学曙光普照世界以来，人们一直兴致勃勃地期望看清周围世界越来越小的细节。生物学家希望能研究细胞、细菌、病毒和胶粒的结构，材料科学家希望能看清金属、晶体和瓷器的非均匀性和缺陷，而在地质学中，使用显微镜来研究岩石、矿物和化石的细致结构使人们得以深刻认识地球起源和宝贵矿产资源。作为研究细胞、病毒和蛋白质结构的良好途径之一的透射电子显微镜，因其可以直观地观测分立大分子颗粒的空间结构，就成为了生物大分子结构领域的极有潜力的研究工具。而大多数显微镜属于以下三种基本类型之一：光学显微镜、带电粒子（电子和离子）显微镜或扫描探针显微镜。透射电子显微镜是带电粒子显微镜，由四大主要组件构成：电子光学镜筒、真空系统、必需电子元件（用于使电子束聚焦并偏向的透镜组，用于产生电子源的高压发电机）和控制软件。现代透射电子显微镜通常由操作控制台和控制面板构成，操作控制台位于垂直镜筒之上并且内含真空系统，控制面板安装在便于操作员使用的地方。显微镜应完全密封，以减少环境干扰。显微镜还可远程操作，操作员无需进入仪器环境，这对操作员和仪器均有益处。简单来讲，透射电子显微镜就是以电子束为照明光源的显微镜，本质就是通过外部电磁场的作用使电子束产生弯曲从而形成电子束的“透镜”。由于电子经过高电压加速后的波长极短（如经过200 kV 电压加速的电子的波长仅为0.025 ?），所以电子显微镜的分辨本领大大优于光学显微镜。事实上，现代电子显微镜的分辨率已经达到1 ?的水平（但是相比于电子的波长，电子显微镜的分辨本领仍有相当大的潜力）。透射电子显微镜和透射光学显微镜的成像原理是基本一致的。总体来讲，透射电镜的工作原理就是：由电子枪发射出来的电子束，在被抽成高真空状态的镜腔通道中沿着光轴方向穿过聚光镜；通过聚光镜后，电子束便会聚成一束极细、明亮而又均匀的光斑，照射在放置于样品室内的样品上；入射电子与样品之间会发生各式各样的相互作用，除了直接透过的电子外，其他电子都会与样品内部原子发生相互作用而被散射，因为不同的原子和不同的作用距离都会影响到散射电子的空间出射角度，因此透过样品后的电子束将携带有样品内部的结构信息；然后经过物镜的会聚调焦和应用光阑把非弹性散射电子阻挡后，电子束被初级放大并进入下级的中间透镜和投影镜系统进行进一步放大成像；最终被放大了的电子影像投射在观察室内的荧光屏板供使用者观察并可被置于观察室下部的CCD 记录。为了保证电子显微镜内部的电子光路状态的稳定性和消除由于空气带来的电子散射，电镜内部都是高真空环境。而理想状况下，人们期望生物大分子要存在于其完全适应的、符合本体真实生存环境的溶液中。这样就引发了一个矛盾：即电镜的高真空性和生物样品自然生存环境的矛盾。为了解决这个矛盾，特殊的生物样品制备手段和适当的样品载体以及相应的电镜器件就必须被发展起来。低温（冷冻）技术可避免传统干燥、固定和切片制备工艺造成的样品损坏。然而，虽然传统冷冻技术可避免引入外部物质，但是也会因为冰晶的形成而破坏精致的生物结构，进而损坏样品。玻璃化是一种快速冷冻工艺，该工艺使水分子在冷冻时来不及结晶，而只是形成对样品结构几乎没有破坏的玻璃质（非晶态）固体。低温玻璃化样品也可减少观察期间因射束电子造成的样品损坏，使样品可以更多地或更长时间暴露在更高射束电流下，有利于生成更优质的图像。冷冻透射电子显微镜可使生物分子在其天然生物环境中接受检测，这样即可将这些分子与其他有助了解其结构和功能的关键分子联系起来。此外，玻璃化样品（更准确地说应是迅速冷冻样品）让研究人员可以研究随时间而变的现象，例如柔性蛋白质的结构动态或蛋白质复合物的聚集和解离。通过度量一组反映各瞬间分子形状的图像的变化，科学家可计算移动范围和作用于柔性蛋白质内部的分子力。同样，类似的一组图像可能形成蛋白质复合物装配过程的冻结图像序列，或可反映抗原结合期间的构象变化。冷冻电子显微镜技术（cryoelectron microscopy）是从20世纪70年代提出的，经过近10年的努力，在80年代趋于成熟。它的研究对象非常广泛，包括病毒、膜蛋白、肌丝、蛋白质核苷酸复合体、亚细胞器等等。一方面，冷冻电子显微镜技术所研究的生物样品既可以是具有二维晶体结构的，也可以是非晶体的；而且对于样品的分子量没有限制。因此，大大突破了X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量（小于100KDa）样品的限制。另一方面，生物样品是通过快速冷冻的方法进行固定的，克服了因化学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的生活状态。现在，冷冻电子显微镜都具备自动图像采集系统。CCD(charg