应用正交测验法优选巨菌草组培诱导和分化培养.docVIP

　　应用正交测验法优选巨菌草组培诱导和分化培养基----生物学论文 --摘要 目的:采用正交设计法初步建立巨菌草的组培技术体系，包括外植体的选择及消毒、培养基配方、培养条件、愈伤诱导、幼苗分化、生根、炼苗移栽等方面，利用该优化的组培体系，采用农杆菌介导法，转入耐寒基因ICE1，探索巨菌草的转基因体系，为巨菌草的遗传改良奠定基础。 关键词： 正交设计法，优化，组培 Abstract objective: using orthogonal design method to establish a seed giant JunCao technology system, including the choice of explant and disinfection, formula of culture medium, culture conditions, callus induction and differentiation, rooting seedling, seedling transplanting smelting, etc., by using the optimized transformation system, adopts the method of agrobacterium mediated, turn into cold resistant gene ICE1, explore the giant JunCao system of geically modified (gm), lay a foundation for giant JunCao geic improvement. Keyethod, optimization and transformation 1 引言 巨菌草隶属单子叶植物禾本科狗尾草属，是一种适宜在热带、亚热带、温带生长和人工栽培的高产优质菌草。可作为栽培香菇、灵芝等49种食用菌、药用菌的培养料，同时还可作为饲料及水土保持的优良草种，目前也被用于生物发电、制造燃料乙醇、水质净化等能源和环保用途。巨菌草属于典型的四碳植物，具有很高的光合速率，且粗蛋白含量很高。因此，巨菌草的遗传改良对发展菌业、畜牧业、能源业等具有十分重要的意义。 近几年，巨菌草的利用发展很快，已在我国南方大面积栽培，但在北方因无法越冬而推广受到限制。长期以来，巨菌草的品种选育基本上依靠常规育种方法，无法解决巨菌草耐寒性改良的问题。植物基因工程技术的发展为巨菌草的耐寒性遗传改良提供了一种很有潜力的手段。自细胞全能性理论提出以来，在无数科学家的努力下，植物组织培养技术经过近百年的发展历程后已经日趋完善和成熟。单子叶尤其是禾本科植物的组织培养一直是个难点，无论愈伤组织的诱导还是再分化体系的建立，单子叶植物都比双子叶植物困难得多。近几年来禾本科模式植物水稻的农杆菌介导的粳稻遗传转化体系已日趋成熟，为单子叶植物的组织培养和遗传转化提供很好的技术基础。 植物的耐寒基因是由多基因控制的数量性状，因此单独改变某一个或几个耐寒基因对植株耐寒性的提高没多大影响。ICE1基因是在低温时诱导CBF表达的一个转录激活因子，ICE1基因在低温时能特定地结合到CBF3的启动子序列上，诱导CBF3的表达，拟南芥中的CBF3能刺激四十多种胁迫诱导基因的表达，如rd29，cor15A，cor47等（Michael F et al., 2001; Visl，加水980ml，配成2%新洁尔灭溶液。 （2）方法：将配好的2%新洁尔灭溶液倒入喷雾器内，进行均匀喷雾。 （3）注意事项： ①墙壁、角落、地面喷雾要均匀，不要遗漏； ②注意安全，在喷房顶时，要特别小心，防止药液雾滴掉入眼睛。 2、无菌室和培养室的灭菌：用甲醛和高锰酸钾熏蒸，1年中熏蒸1-2次。 （1）配方：每立方米空间用甲醛10ml加高锰酸钾5g的配比液熏蒸。 （2）方法：首先房子要密封。然后在房子中间放一口缸或大烧杯，将称好的高锰酸钾放入缸内，再把已称量的甲醛溶液慢慢倒入缸内，完毕，人迅速离开，并关上门，密封3天。 （3）注意事项： ①操作前要戴好口罩及手套； ②倒入甲醛时要小心，因为甲醛遇到高锰酸钾会迅速沸腾，并产生大量烟雾。操作时人要迅速避开烟雾； ③3天后，打开房间，搬走费液缸；一周后，方可进入操作。 3、在已经熏蒸过的房间内，用70%酒精纱布擦洗培养架、工作台。 4、用紫外灯照射20—30min。 5、使用前，再用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。 （二）培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法） （1）洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。自然晾干或烘箱干燥。 （2）包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。 --（3）装水：