高级染色流程.docxVIP

免疫组织化学　　（一）、仪器设备　　1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅　　（二）、试剂　　1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L.　　2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g.　　3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0，加水至1000ml.　　4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0，加水至1000ml.　　5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。　　6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。　　7）封裱剂：　　a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；　　b、油和TBS（或PBS）配制。　　8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。　　（三）、操作流程　　1、脱蜡和水化　　脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。　　1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；　　2）无水乙醇中浸泡5分钟；　　3）95%乙醇中浸泡5分钟；　　4）70%乙醇中浸泡5分钟；　　2、抗原修复　　用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。　　1）抗原热修复　　（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。　　（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。　　（3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。　　2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。　　3、免疫组织化学染色　　SP法　　1）脱蜡、水化；　　2）PBS洗2～3次各5分钟；　　3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；　　4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复；　　6）PBS洗2～3次各5分钟；　　7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。　　8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。　　9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。　　10）PBS洗3次各5分钟；　　11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；　　12）II抗中可加入0.05%的tween-20.　　13）PBS洗3次各5分钟；　　14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；　　15）PBS或自来水冲洗10分钟；　　16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；　　17）自来水冲洗10～15分钟；　　18）脱水、透明、封片、镜检。　　SABC法　　1）脱蜡、水化。　　2）PBS洗两次各5分钟。　　3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。　　4）抗原修复。　　5）PBS洗5分钟。　　6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。　　7）滴加Ⅰ抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。　　8）PBS洗三次每次2分钟。　　9）滴加生物素化二抗，20℃～37℃20分钟。　　10）PBC洗3次