实验一酵母核糖核酸的分离及组分鉴定1.docVIP

实验三 蛋白质的提取、分离纯化及定量 实验目的 1.学习蛋白质的提取方法。 2.掌握凝胶过滤法使蛋白质脱盐。 3.掌握紫外分光光度法或考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。 实验原理 蛋白质的提取：盐析法或等电点法。 蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态与解离程度受溶液的酸碱度影响，当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质 颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点，在等电点时，蛋白质的溶解度最低，可用于提取蛋白质。 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵中析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆沉淀反应，可用于提取蛋白质。 蛋白质的分离纯化 蛋白质溶液中如含有无机盐离子，用葡聚糖凝胶过滤法可使蛋白质与无机盐分离，效果理想。葡聚糖凝胶（商品名SepHadex），又称右旋糖苷，它是葡萄糖通过α－1,6－糖苷键形成的长链，与交联剂环氧氯丙烷交联生成（见图）。 在合成凝胶时，控制交联剂环氧氯丙烷的用量，可以制成网孔大小不同的葡聚糖凝胶（见图），即不同规格凝胶。葡聚糖凝胶从G-10到G-200有多种类型，G后的数字由每克干胶充分溶胀后吸水的克数乘以十所得，同时也代表网孔大小，G后的数字越小，其溶胀后的网孔越小，一般G-10到G-50适用于蛋白质与小分子或无机盐的分离，G-75到G-200适用于分子量大于一万的蛋白质的分离。本实验用G-25使蛋白质与硫酸铵分离，当蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的硫酸铵扩散进入G-25的网孔中，而大分子的蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻在凝胶颗粒（固定相）的外面，加入洗脱液（流动相）洗脱，因大分子蛋白质从凝胶颗粒的缝隙向下洗脱，阻滞力小，可首先被洗脱下来，故洗脱体积小。而小分子的硫酸铵因扩散进入凝胶颗粒的网孔中，阻滞力大，需要较大的洗脱体积才能从柱中洗出，这样可使蛋白质与硫酸铵很容易分离开。 （三）蛋白质的定量----考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量 考马斯亮蓝G-250是一种能使蛋白质染色的染料，在酸性溶液中，考马斯亮蓝本身呈红褐色，在465nm处有最大光吸收。加入蛋白质后，该染料能与蛋白质快速结合，生成染料－蛋白质复合物，该复合物的最大光吸收峰移向595nm处，消光系数更大。蛋白质浓度在一定范围内（1——1000ul/ml）与考马斯亮蓝反应的复合物在595nm处的吸光度与蛋白质的浓度呈直线关系，故可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即反应完全，其复合物在1h内保持稳定， 仪器、试剂 实验步骤 一.蛋白质的提取 取鸡蛋一只，取蛋清加无离子水至50ml，搅拌至成均匀的胶体溶液。用六层纱布过滤，取1—2ml蛋清溶液于试管中，加入硫酸铵至饱和状态，2000r/min离心10min,去上清液，加入水至沉淀刚好溶解，测量体积。 二.蛋白质的脱盐——凝胶过滤 1.溶胀凝胶 用无离子水浸泡SepHadex G-25 24小时以上（中间换一次水）或用无离子水沸水溶胀2小时左右。 2.凝胶装柱 安装层析装置，将层析柱固定在铁架台上，两端分别连接乳胶管。上段与洗脱液连通，下端装一螺旋夹调控洗脱速度，先用少量洗脱液洗柱并排除乳胶管中的气泡，待柱中洗脱液维持1cm高度时，拧紧螺旋夹。 将溶胀好的G-25依次倒入层析柱中，使其自然沉降，沉降后凝胶柱的高度为层析柱的3/4~4/5且柱床面平整比较理想。拧松螺旋夹排除多余的洗脱液，床面上维持1cm高的洗脱液，拧紧螺旋夹。 3.加样洗脱 用刻度吸管吸取1ml样品（蛋白质－硫酸铵溶液），其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间有一清晰界面。拧松螺旋夹，使样品全部进入凝胶柱中，接通洗脱液，开始洗脱并收集洗脱液。 4.收集检查 用刻度离心管收集洗脱液，每管收集1ml。 三.蛋白质的定量----考马斯亮蓝法测蛋白质含量 ⑴绘标准曲线的制作 取6只干净试管，按下表分别向每支试管内加入各种试剂1ml,加入3ml考马斯亮蓝，,混匀。 管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液（mg/ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 A595 ⑵取三只试管，按下表操作 待测管（U） 标准管（S） 对照管（B）