实验六质粒DNA的提取与酶切.docVIP

质粒DNA的提取和酶切 实验原理 质粒是一种双链的共价闭合DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒一般来自细菌，分离和纯化质粒DNA的方法很多，但都包括以下几个步骤，细菌的培养和质粒的扩增、菌体裂解、质粒DNA的纯化。在细胞内，质粒以超螺旋的形式存在，在一些条件下，一条链和多处断裂则另一链能自由的旋转形成开环DNA分子。加热或者碱处理虽然可以解开双链中的氢键，但随着冷却或PH恢复到中性它们又能很好的复性到原来的共价闭合环，线性DNA分子却仍处于变性状态。 限制性内切酶以双链DNA为底物，环状和线性DNA均可作为底物，在合适的反应条件下，是两条核糖链上特定的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在电场作用下可以从负极向正极移动，相对分子质量越小，迁移越快，相对分子质量越大，迁移越慢。DNA的构想对迁移也有一定的影响，向阳极迁移的速度超螺旋大于线性，线性大于开环，电压在一定的范围线性DNA的迁移速率与所加的电压成正比。 一 细菌培养 操作方法： 培养基 培养基从形态上可分为液体培养基和固体培养基，根据有无抗生素和其他选择性药物又分为普通培养基与选择培养基。常用的培养基是以LB液体培养基为基础的各类选择性和非选择性培养基。 LB液体培养基： 胰化蛋白胨2.5g 酵母提取物1.25g 氯化钠2.5g 加水溶解，用5mol/LNaOH调节pH值到7.0。定容至250ml，高压灭菌20min。 固体培养基： 普通培养基 按LB配方配制液体培养基，加入琼脂（1.5%）高压灭菌20min，取出后在无菌条件下铺制平板。 ②选择性培养基 将消毒好的固体培养基置于室温条件下，降温至50℃左右时无菌条件下加入抗生素或其他必须添加的成分，每毫升菌液加入氨苄青霉素贮存液（50mg/ml）1ul。摇匀后，再将菌液分别倒入已灭菌的平皿中，培养基厚度2-3mm，室温下固化。 细菌的培养 大多数大肠杆菌在保存培养基中存活数年，在-70℃低温箱或液氮中可长期保存。常用保存液为甘油（80%或100%）和DMSO溶液。 菌种复苏 无菌条件下用接种环或灭菌牙签挑取少许冻结的菌种接种到平皿上，37℃培养8-12小时。或按“3、小量培养”操作。 固体培养 用于单菌落或转化后抗性菌落的筛选。无菌条件下用接种环从冻存或新鲜的菌种中粘取少量菌液，点到平皿培养基的边缘上，以此为起点划一道划痕，接种环灭菌，交叉第一道划痕划一连续的波浪线，接种环灭菌，与第一条波浪线的最后划痕交叉划第二条波浪线，如此重复直至划满平板培养基，注意波浪线之间不能交叉重叠，37℃培养8-12小时。 小量培养 取灭菌试管加入3-5ml液体培养基和3-5ul氨苄青霉素溶液，用无菌牙签从固体培养基细菌平皿中挑取一单菌落接入液体培养基中，或取菌液5-10ul接入液体培养基，封口，37℃振荡培养6-12小时。 大量培养 已灭菌的500ml三角瓶中加入100-200灭菌的液体培养基及相应量的氨苄青霉素溶液，0.5%-1%的浓度接入菌液，封口，37℃振荡培养至OD600nm0.6-0.8。’-OH和5’-P基团的DNA片段。 限制性内切酶产生的DNA片段末端通常有两种形式：其一，两条链的断裂位置是交错的，形成具有凸出末端的DNA片段，这样的末端称之为 粘性末端。有的内切酶切割后产生3’粘性末端，即切割片段末端的3’比5’端多1到几个核苷酸；而另一些限制性内切酶切割后产生5’粘性末端。其二，两条链上的断裂位置处在识别序列的对称结构中心，这样断裂的结果形成具有平末端的DNA片段。 几个定义：具多识别序列的限制性内切酶 同裂酶（isoschizomer） 稀切限制性内切酶(稀切酶rare cutting enzymes) 同尾酶(isocaudamer) （三）反应系统 1、底物DNA 1)侧面序列和位点偏爱（Site Preferences）：经实验只含识别序列的寡核苷酸是不会被限制性内切酶切割的。大概在识别序列两端各伸展1或2个核苷酸，就可被低效切割，只有当侧面序列增加到一定长度后，才能达到正常的反应速率。并且侧面序列中的碱基组成对于个别切割位点的切割效率也有影响。有些酶有位点偏爱现象，这种现象被认为与不同位点的识别序列的侧面序列不同有关。 2）DNA的甲基化：制备的DNA样品往往在特定的核苷酸碱基对上被甲基化酶甲基化，一旦在识别序列中的核苷酸碱基被甲基化，则严重影响切割效率，但并不是所有的限制性内切酶都受甲基化序列的抑制。此外，限制性内切酶切割线性DNA分子的效果高于切割超螺旋DNA或病毒DNA。 3）DNA纯度：在DNA样中若含有一定量的DNase、蛋白质、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和高浓度的盐离子，均会影响限制性内切酶的切割效率。在纯度不高的情