植物制成的疫苗后持续表达长期冷冻保存的抗原表达烟草细胞培养.docVIP

烟草植株中的抗原表达细胞在长期冷冻化后制成的植物性疫苗的连续表达 摘要：和当今的疫苗生产方法相比，在植物细胞中提取生产疫苗的方法有较多的优点。建立持续供应一个稳定的种子储备疫苗是生产系统的一个重要组成部分。因此，玻璃化冷冻保存方法是适用于非转基因和三个不同的抗原表达的转基因烟草（NT-1）系中。预培养的悬浮培养，在玻璃化冷冻前1天，通过冷冻保存过程对细胞生存产生了有效的作用。在预培养培养基中加入0.3mol的甘露醇来维护细胞的活力是必需的。实验也在玻璃冷冻化之前对培养基是否用热休克处理做比较，结果表明热休克处理对于冷冻保存后细胞的恢复是不必要的。所有培养基在液氮下悬浮培养，储存时间间隔从1小时到1年不等。抗原表达用酶联免疫吸附量化法来检验。从冻存保存过的培养基中分离的细胞的抗原表达程度与非冻存处理的培养基细胞表达程度存在差异。透射电子显微镜，结果显示用冷冻保存过后的细胞仍能保持结构的完整性。 关键词：LT-B Newcastle疾病病毒 NT- I悬浮培养 玻璃化冷冻 一、简介 转基因植物细胞培养是一个有吸引力的替代同源蛋白的生产，如医药蛋白质，因为它避免了污染物的存在在哺乳动物或其他生态系统中。要符合现有的监管要求，植物细胞培养表达药用蛋白会需要一致和稳定的操作支持。冻存技术的应用为快速恢复稳定的基本细胞和培育新菌株提供了一个方便方法的途径。 超低温冷冻保存是生物材料在超低温的存储一般是在-196°C对所有生化和物理控制进行操作控制的过程。这种方法通常被应用于减少体外培养有价值的植株、昆虫细胞和哺乳动物细胞器的保存。超低温冷冻为库存材料在原来的形式和特征状态恢复和在一段时间内重复再生产提供了一种方法。 冷冻保存的过程可以包括预处理如热休克（Reinhoud等，1995），干燥（张等，2001），冷驯化（Leunufna和凯勒2003年），活细胞玻璃化冷冻（Reinhoud等）。1995年Sarkar和奈克1998年）。玻璃化冷冻是当植物组织细胞内的水被转换为冻结、玻璃状的状态时发生的，这样防止了在冻结/解冻过程中致命的冰晶的形成。当样品解冻时生物就恢复活性。我们的实验是Reinhoud（1995年）等人的研究的基础上。实验表明，两步冻结和玻璃化冷冻方法在烟草植株培养中发挥很好的作用。玻璃化在两步法中的优点是所需的预培养时间更少，为有必要再为冷却设备细胞生存率更高且更快地恢复花昂贵的成本。 我们对转基因细胞系中抗原表达的的研究重点放在对液氮条件下存储从1小时到1年不等的时间的冷冻技术的研究。从不同的冻结时间间隔的再生细胞的抗原表达程度的检测，我们发现，细胞在经过冷冻保存后的抗原持续表达与没有经过冷冻处理的细胞存在较大的差异。 二、结果与讨论 蛋白疫苗的抗原和在NT1细胞中的抗原表达链 大肠杆菌不耐热的LT肠毒素引起在人类和一些动物的严重腹泻。 LT是一个以蛋白质为主要成分的毒素，是一个11.6 kDa的penteric环组成相同的乙亚基（LT-B的）和一个27 kD的一个亚基（LTA），它含有一种有毒的ADP核糖转移酶活性（格勒1992年）。五个B亚基无毒，只负责约束的holotoxin神经节苷脂，这是在真核细胞细胞膜上发现GM1的受体。抗原表达细胞基因组，CLT105- 48， NT1的细胞培养基与一构建的为表达对大肠杆菌热不稳定肠毒素的基因片段转化过程中恢复的蛋白质，然而，LT - A亚基编码序列G192修饰发生突变，来减少其毒性。CLT101-14决定的抗原表达链也包含了对大肠杆菌的LT - A的基因 和LT- B亚基的表达，然而，在LTA的编码序列没有发生突变，这表明了和CLT105的构造没有关系而在于其活性蛋白的活性表达。 新城疫病毒属于家庭Paramyxoviridae和许多鸟类的重要病原物种。它在全球家禽业的交易引起破坏性的损失。新城疫病毒粒子的表面包含两个功能的糖蛋白，融合（F）和血凝素 - 神经氨酸酶（HN）蛋白质（黄等，2004）。 HN是一个约74 kDa的蛋白质，它包含两个受体识别和神经氨酸酶（NA）的病毒活动，在感染疾病中起关键性作用。转基因细胞链CHN -18，表达HN蛋白。 培养基的影响 最初，我们测试了三种不同的液体培养基的非转基因细胞系的生长情况，设计了LSg,KCMS，和NT - 1细胞系的抗体表达的冷冻保存研究。在LSg培养基中，对非转基因细胞培养的生长产生负面影响，反之，在KCMS和NT- 1培养基中生长却旺盛。最可能的原因是，LSg培养基中与植物机体的生长浓度和KCMS和NT- 1培养基相比存在不同。LSg培养基中只有0.05㎎／L的 2,4-D，而KCMS培养基中含有0.2㎎／L 的2,4-D和0.1 ㎎／L的激动素且NT- 1培养基中含有2.21㎎／L 的2,4-D。和LSg