医学优秀论文《无糖对体外培养的神经前体细胞损伤的影响》.docVIP

　　医学优秀论文《无糖对体外培养的神经前体细胞损伤的影响》 --无糖对体外培养的神经前体细胞损伤的影响 [关键词]神经前体细胞;细胞培养;葡萄糖 [摘　要]目的:研究无糖处理对体外分离培养神经前体细胞(neural precursor cells, NPCs)的存活、分裂及分化能力的影响。方法:培养的第4~6代新生大鼠海马区NPCs给予无糖培养基处理6 h后,分别于处理后第0、1和7天测定细胞MTT代谢率、台盼蓝染色细胞率、5′-溴-脱氧尿嘧啶(5′-bromo-deoxyuridine, BrdU)参入率及分化细胞内胶质细胞纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇酶和半乳糖脑苷蛋白表达,判定NPCs存活、分裂和分化能力的改变。结果:(1)无糖处理后的不同时间点台盼蓝染色阳性细胞率在NPCs无糖组较NPCs对照组增加。无糖处理后即刻和1 d,NPCs无糖组较神经元无糖组减少,7 d时两者相近。(2)无糖损伤后0 d和1 d,NPCs无糖组的MTT代谢率较NPCs对照组明显降低(P0.05)。在不同时间点,NPCs无糖组的MTT代谢率较神经元无糖组均明显增高(P0.05)。结论:无糖可以损伤NPCs,对于NPCs的分裂和分化能力无直接的影响。 维持正常的脑组织结构和功能取决于足够的能量供给,葡萄糖是神经细胞的唯一能量。在新生儿,80%以上机体代谢的葡萄糖供应脑代谢,这一比例在早产儿更高。在新生儿,尤其是早产儿由于自身特点,极易发生新生儿窒息、新生儿低血糖症等许多可以引起神经细胞的葡萄糖供应减少或终止的疾病,当供给葡萄糖停止时,脑细胞就失去了能量供应,脑的正常生理活动立即受到影响,出现包括惊厥在内的一系列神经系统症状,重者将导致神经细胞不可逆损伤[1,2]。神经前体细胞(neural precursor cells, NPCs)作为具有分化潜能和自我更新能力的细胞,在儿童,尤其是正处于发育过程中新生儿的神经系统占有重要地位,一旦受到损伤势必影响神经系统正常发育,现在尚不清楚葡萄糖供应停止对NPC的直接影响。本文通过体外培养NPCs,制作无糖损伤NPCs模型,研究无糖对NPCs存活、增殖和分化的影响。 1　材料与方法 1.1　NPCs的培养和鉴定[3,4] 生后1 d的新生EM/F12(Gib-coBRL)加B27的无血清培养基稀释,同时加20μg#8226;L-1碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast groa),代写论文以1×105ml-1细胞密度接种于培养器皿中,置于孵育箱(CO2体积分数为8%),于37℃悬浮培养。每5天添加bFGF,终(质量)浓度为20μg#8226;L-1,每20天传代一次,每代NPCs应用小鼠抗大鼠nestin抗体(BD Biosci)通过免疫组化方法鉴定nestin表达,应用5′-溴-脱氧尿嘧啶(5′-bromo-deoxyuridine, BrdU,Sigma)参入法鉴定NPCs分裂能力,用含2 % (体积分数)胎牛血清(fetal bovineserum,FBS,GibcoBRL)的DMEM诱导NPCs分化,应用兔抗大鼠胶质细胞纤维酸性蛋白(glial fibrillaryacid protein,GFAP)抗体,兔抗大鼠神经元特异性烯醇酶(neuron special enolase,NSE)抗体(北京中山生物工程公司)和小鼠抗大鼠半乳糖脑苷(galactocere-broside,GalC)抗体O1(NIH惠赠)通过免疫组织化学染色确定分化细胞性质,鉴定NPCs的分化能力。第4~6代NPCs用于实验。 1.2　海马神经元的培养[5] 取生后1 d的EM稀释,以1×105ml-1细胞密度接种于包被多聚赖氨酸的培养器皿中,于8%(体积分数) CO237℃培养。体外培养48 h后用含10%(体积分数)马血清(horse serum,HS,Gibco-BRL)的DMEM换液,第5天加阿糖胞苷(10μmol#8226;L-1)抑制胶质细胞的生长,24 h后换出,继续于10%(体积分数)HS/DMEM中培养,每3~4天半量换液,培养7~10 d细胞用于实验。 1.3　实验分组 实验处理前,NPCs以与神经元相同的细胞密度种植在包被有多聚赖氨酸培养器皿中,待附壁生长后用于实验。两种细胞均分为实验组和对照组。实验组给予无糖细胞外液(124 mmol#8226;L-1NaCl, 4.9mmol#8226;L-1KCl, 1.3 mmol#8226;L-1MgSO4, 2.0 mmol#8226;L-1CaCl2, 1.2 mmol#8226;L-1KH2PO4, 25.6 mmol#8226;L-1NaHCO3)培养6 h后,更换为正常培养基继续培养,对照组用正常细胞外液代替无糖培养液培养[6]。 1.