医学技术论文《提高石蜡包埋组织中提取DNA质量的实验研究》.docVIP

　　医学技术论文《提高石蜡包埋组织中提取DNA质量的实验研究》 --提高石蜡包埋组织中提取DNA质量的实验研究 [摘　要]　目的:确定从石蜡包埋组织中提取DNA的最佳条件。方法:改变石蜡切片厚度、组织脱蜡时间、消化液蛋白酶K浓度、组织消化时间等参数,组合出96种不同提取DNA的条件,比较各种条件下所提取DNA的数量和质量。结果:各种条件均可以提取出一定数量的DNA,但有些条件所提取的DNA不适合于做PCR及DNA序列测定。结论:从石蜡包埋组织中提取DNA的最佳条件为,10.0μm组织切片;切片脱蜡2次,脱蜡时间分别为2 h和12 h;消化液中蛋白酶K浓度500 mg#8226;L-1;组织消化12 h。 [关键词]　石蜡包埋;DNA/分离和提纯;聚合酶链反应;序列分析,DNA 从石蜡包埋组织中提取DNA可以解决在短期内难以收集到大量有用标本的难题,但组织经甲醛、石蜡包埋后很容易引起DNA的交联和降解,使研究工作受限。如何从石蜡包埋组织中提取高质量的DNA是一个迫切需要解决的问题。本文经过多次尝试,通过改变石蜡切片厚度、组织脱蜡时间、消化液蛋白酶K浓度、组织消化时间等实验参数摸索出一组最佳提取DNA的条件,经检验可以满足PCR、DNA荧光标记、DNA序列测定等分子生物学实验要求。 1　材料与方法 1.1　标　本　 4年前手术切除的散发型甲状腺髓样癌组织,组织块全部为癌组织,质地均一,经10%中性甲醛固定12 h后石蜡包埋,室温存档至今。 1.2　试　剂　 蛋白酶K、Tris碱、EDTA、SDS为Sigma公司产品,二甲苯、乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、醋酸钠为日本和光纯药工业株式会社产品,TaKaRa Ex Taq PCR反应试剂盒为日本宝酒造株式会社产品,QIA quick Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒为德国QIAGEN公司产品,ABI PRISMBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reac-tion Kit荧光标记试剂盒为美国Applied Biosys-tems公司产品。扩增RET基因第11外显子PCR引物由日本遗传子研究所合成,碱基序列:11F 5′-ACAGATCCACTGTGCGACGAG-3′, 11R5′-ATCTTGAAGGCATCCACGGAG-3′。 1.3　条件设定　 根据石蜡切片厚度(2.5、5.0、10.0μm)、组织切片脱蜡时间(切片脱蜡2次,时间分别为2、2 h和2、12 h)、消化液中蛋白酶K浓度(125、250、500、1 000 mg#8226;L-1)、组织消化时间(4、8、12、24 h)等参数的不同,排列组合出96种不同条件,分别用于提取DNA。 1.4　提取DNA方法　 ①石蜡组织连续切片,2.5μm切片4片为1组,共计32组;5.0μm切片2片为1组,共计32组;10.0μm切片1片为1组,共计32组。切片分别置入1.5 ml Eppendorf管中(A管)。②A管中加1.0 ml二甲苯,置40℃恒温水浴中以80次/min振荡脱蜡,切片脱蜡2次,时间分别为2、2 h和2、12 h。③1.0 ml无水乙醇漂洗切片2次,置75℃水浴中20 min后离心去上清,真空干燥使组织切片完全干燥。④加入细胞裂解液300μl(蛋白酶K浓度根据分组情况不同分别为125、250、500、1 000 mg#8226;L-1, 10 mmol#8226;L-1Tris-HCl,140 mmol#8226;L-1NaCl,2 mmol#8226;L-1EDTA,0.5%SDS),置50℃恒温水浴中以40次/min振荡消化组织,时间根据分组情况不同分别为4、8、12、24 h。⑤置95℃水浴中10 min,加入300μl体积比25∶24∶1的苯酚/氯仿/异戊醇混合液轻轻翻转10 min后13 000 r#8226;min-1离心5 min,水相移至另一个Eppendorf管中(B管)。⑥A管中加入300μlTE缓冲液轻轻翻转3 min后13 000 r#8226;min-1离心5 min,水相移至B管。⑦B管中加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)混合液轻轻翻转10 min后13 000 r#8226;min-1离心5 min。上层水相移至另外一个Eppendorf管(C管)。必要时此步骤可重复1～2次。⑧C管中加入3倍体积予冷的无水乙醇及1/10体积的醋酸钠混均,-20℃放置15 min后13 000 r#8226;min-1离心5 min,弃上清。⑨加入予冷的80%乙醇1 ml轻轻翻转3 min后13 000 r#8226;min-1离心5 min,弃上清。10真空干燥后加入50μl TE缓冲液。 1.5　不同方法提取的DNA量的检验