毛莨总苷心血管药理功能分析.doc

　　毛莨总苷心血管药理功能分析 --第一部分毛茛总苷对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响 1药物、仪器和动物 1.1药物 DMEM液体细胞培养基，Hyclone公司，批号：NSG0054 胎牛血清(FBS)，Hyclone公司，批号胰蛋白酶，Sigma分装，批号：DH355-2 磷酸缓冲液(PBS)，北京鼎国生物技术有限责任公司 青霉素，Sigma分装,批号:DH231-1 链霉素，Sigma分装,批号:DH325 噻唑蓝(MTT)，Sigma分装，批号：DH343-1 三氯醋酸,Genebase,批号:G2365 二甲基亚砜，北京鼎国生物技术有限责任公司 毛茛总苷，广东药学院药理教研室制备 重酒石酸去甲肾上腺素注射液，酚妥拉明注射液，尼莫地平注射液，均购自上海禾丰制药有限公司。 1.2仪器 细胞培养箱,美国Thermo电子电器公司 生物荧光倒置显微镜（Leica IM50），德国莱茨公司 净化工作台（Sodel680型）,日本Bio-Rad公司 酶标仪2（ELX800），美国Biotech公司 低速离心机（LD4-2A型）,北京医用离心机厂 立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-30SⅡ）,上海博迅实业有限公司医疗设备厂 移液器，上海艾本德生物技术国际贸易有限公司 酸度计（PHS-25型）,上海雷磁仪器厂 磁力搅拌器（JB-2型）,上海雷磁新泾仪器有限公司 回旋式振荡器（HY-5型）,江苏金坛市宏华仪器厂 数显鼓风干燥箱（GZX-9240MBE）,上海博迅实业有限公司医疗设备厂 电热恒温水槽（DK-8D型）,上海一恒科技有限公司 自动双重纯水蒸馏水器（SZ-93）,上海雅荣生化设备仪器有限公司 96孔培养板,Corning 3.5cm培养皿,Corning 25 cm2或75cm2 培养瓶,Greiner bio-one 15ml或50ml离心管,Falcon 1.3动物 SPF级SD成年大鼠，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2003-002，粤监证字2005A010；体重200g。 2实验方法 2.1血管平滑肌细胞的分离和培养 (1)PBS液:取PBS浓缩液一瓶(50ml)及8.5gNaCl粉末,加三蒸水定容至1L,搅拌混匀，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。(2)D-Hanks缓冲液的配制：NaCl 8g，KCl 0.4g，NEHPO4#8226;12H2O 0.1342g，KH2PO40.06g，三蒸水1000ml，调PH值至7.4，0.22μm微孔滤膜抽滤除菌，置4℃保存备用。(3)含10％或20％胎牛血清（FBS）的细胞培养液:用低糖的DMEM液体培养基按9:1或4:1的体积比与胎牛血清混匀，即得到含10％或20％FBS的细胞培养液，分装，4℃保存。(4)0.25％胰蛋白酶：称取所需量的胰蛋白酶粉末，加PBS液溶解，调节PH7.2，无菌过滤，分装，-20℃冷冻保存。(5)分离血管平滑肌细胞所用的手术工具:解剖器械（两把普通手术剪，两把止血钳，两把眼科直剪，一把眼科弯剪和三把弯头眼科镊），长吸管数根，两套平皿，一把自制细胞刮刀，121℃,20min高压灭菌，烘箱干燥备用。PBS液、D-Hanks缓冲液、胰酶、培养液临用时均用37℃预热。 大鼠断头死处后,在无菌环境下,迅速分离出胸主动脉置于玻璃平皿内的D-Hanks缓冲液中，去除管腔内血液，剥离外膜及附着组织，将动脉段纵向剪开，使内膜朝上平摊于平皿上，用自制细胞刮刀轻轻刮去内皮细胞，然后将中膜平滑肌剪切成若干块面积约为2mm2组织小块，均匀贴在培养皿上，置于37℃、5%CO2培养箱中，2小时后加入培养液，加入量以刚没过组织块为宜。培养液为含20%胎牛血清的DMEM培养基，2-3天换液一次，每次换液为半量换液。待细胞生长至亚融合状态时，用0.25％胰蛋白酶消化，转入25 cm2培养瓶，用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行传代培养。倒置相差显微镜下观察单个平滑肌细胞呈梭形或带状,有多个细胞突起,胞浆丰富,胞质密度高,不透明,核卵圆形居中,有多个核仁。细胞生长致密时平行排列成束,部分重叠,表现为典型的“谷峰状”生长。本实验所用的VSMC为传代至8～9代的细胞。 2.2细胞计数 台盼蓝（Trypan Blue）是一种常被使用于细胞染色的染剂。Trypan Blue无法穿透活细胞的细胞膜，但是当细胞受伤或死亡，细胞膜破损时，Trypan Blue则可以通透细胞膜进入细胞內，使细胞染成蓝黑色。利用此一特点，配合血球计数板的使用，则可以在显微镜底下，分辨出细胞样本中的活细胞与死细胞，以方便细胞计数。 乙醇清洁细胞计数板（counting chamber）及专用盖玻片，用绸布擦干,待其干燥后，用移液枪轻吸细胞悬液（一般为20μl），与0.4％