第12章、组分分析技术.pptxVIP

第三部分 鉴定技术;第12章、组分分析技术;一、蛋白质N端测序原理;PTH-AA STD;R3; 二、影响N端Edman反应裂解率的因素 在测序中往往可以发现，即使N端很均一的蛋白质(第一个循环出现单个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是由于Edman反应是一个化学过程，在其偶联、裂解、转化等步骤都有可能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。 ;例如 三氟乙酸除起裂解作用外，可能与丝氨酸Ser和苏氨酸Thr上的羟基反应，继而部分封闭Ser和Thr的N端α-氨基，导致Ser和Thr时产率突然降低。 丝氨酸和苏氨酸的PTH-衍生物也会部分转化成其他产物，造成产率的降低。 偶联试剂PITC本身也将发生副反应，形成一些“杂质”。;目的：对纯度不足的样品进行定量和净化以成功进行序列测定。 样品：完整的蛋白质或多肽。 纯度：样品中蛋白质或肽的数目，通过SDS和HPLC等方法评估（须90%）。 定量：可以由Bradford/Lowry/BCA法分析蛋白含量,凝胶染色强度、半定量的HPLC等测定。 净化：不含阻碍序列测定的一般干扰物。 这几个因素将决定我们必须进行什么样的样品制备以获得一个成功的序列测定。;样品存在状态;样品量;定量依据;用氨基黑对PVDF膜染色后强度;一般干扰物;测序样品的脱盐;N-端封闭;四、封闭N-末端的测定 有些蛋白质的肽链没有游离的氨基端，较多的情况是氨基端因受到乙酰化或谷氨酸残基自身环化为焦谷氨酸残基而被封闭。此时我们可采用相应方法对封闭N-末端进行测定。;1．乙酰化N-末端 肼解条件下，N端的乙酰基形成乙酰肼。然后，使其与DNS-Cl作用，形成N-乙酰-N’-丹磺酰肼，经乙醚抽提出来后，可应用薄层层析等方法鉴定。 由于乙酰基与氨基形成的酰胺键比较稳定，在部分酸水解条件（如pH 2，105℃ 90min）下有可能产生乙酰基氨基酸，与已知标准化合物对照，也可以应用层析等方法对其加以鉴定。;2．吡咯烷酮羧酸末端 牛肝焦谷氨酸氨肽酶能水解出末端的吡咯烷酮羧酸，从而使剩下的有自由氨基端的肽链可以用Edman方法递减分析。; 3．甲酰基末端 甲酰基常以甲酰甲硫氨酸的形式存在于原核体系的初生肽链的端部。 甲酰氨键比起一般肽键要不稳定得多，所以弱酸条件（如0.5 M HCl的甲醇溶液）下在室温处理48小时，可以使甲酰基水解下来。然后再可仿照乙酰基的测定方法加以鉴定。;案例：尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序;技术路线;SDS分离 ;SDS分离亚基;蛋白回收 ;单亚基纯度鉴定 ;SDS浓缩的电洗脱的亚基;电转移;电转移后的亚基;测序结果;电洗脱或电转移测序的注意事项;12.2、蛋白质序列分析;一、同源性和相似性分析;Blast程序评价序列相似性的两个数据;NCBI提供的Blast服务;Blast任务提交表单（一）;Blast任务提交表单（二）;Blast任务提交表单（三）;提交任务;结果页面（一）;结果页面（二）;结果页面（三）;如何确定一个蛋白是否新蛋白？;二、蛋白质性质分析;1、Compute pI/Mw;结果;2、ProtParam tool ;可预测参数;输入序列：NP_002779;结果;12.3、糖蛋白中糖基组分鉴定及分析;一）、电泳中糖蛋白的染色方法;2、 PAS染色结合硝酸银染色 将PAS-阿利新蓝(alcain blue)法与硝酸银染色方法结合对糖蛋白进行染色。 在经过alcain blue初染之后，再用硝酸银复染，可以检测到1.6 ng/条带的A1-酸性糖蛋白和8-40 ng/条带的黏液素。 该方法比传统的PAS染色法的灵敏度高10倍左右，可用于样品的纯度鉴定和混合物中糖蛋白的检测。 ;3、硼酸根荧光染料 为了提高糖蛋白检测的特异性与灵敏度而开发出来一种苯硼酸荧光染料，在凝胶中直接对糖蛋白选择性地染色。 衍生化反应原理为： 糖环上相邻的羟基与带有荧光基团的苯硼酸根染料反应生成环硼酸化合物。他们考察了该染料和酸性品红对糖蛋白的染色灵敏度，苯硼酸根荧光染料的染色灵敏度可低至25-100 ng,比PAS法高5-10倍。 该荧光染料可用于2-DE分析了细胞混合物中的糖蛋白。 ;糖蛋白在SDS上的染色;糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。 非还原糖必须转化为还原糖再进行测定。;;1、兰－爱农法原理;2.碘量法原理;3.比色法测糖; 2）、苯酚-硫酸法原理 苯酚硫酸法主要用于多糖检测。其原理是：多糖