4酶的提取与分离纯化280.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 0.6/0.416=1.44 9.8/0.416=23.6 500/0.416=1200 * 第五节 纯化方案的设计与评价 一、纯化方案的设计 1 纯化方法的选择依据 根据有效成分和杂质之间理化性质的差异 ▼调节溶解度：沉淀法 ▼根据分子大小、形状的不同： 离心分离，膜分离，凝胶过滤 ▼根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳 ▼根据专一性结合的方法：亲和层析 ▼其它：吸附层析，疏水层析 ★ * 2 纯化方法的排序 先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。 ★ * 二、纯化方案的评价 1 酶活力测定： 酶活力(enzyme activity)又称酶活性，即单位时间内酶促反应的产物生成量. 是酶催化某一化学反应的能力。 ★ * 方法： 在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，用适当方法停止其反应后，再根据产物和底物在物化性质上的差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量。 ★ * 常用的方法 ： ▼化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液 。 ▼分光光度法:利用底物和产物光吸收性质的不同 。 ▼量气法:酶促反应中产物或底物之一为气体。 ▼滴定法（pH值测量法）：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。多用pH电极测。 ★ * 常用终止反应方法： ▼改变反应最适条件： 加酸、碱、加热 ▼加酶变性剂： 5％三氯乙酸 ★ * 酶活力单位：通常采用国际酶学委员会规定的单位。 在纯化过程中，为了方便，可采用自行规定的单位，只要达到可比较的目的即可，如直接以光密度值表示。 ★ * 2 蛋白质浓度测定 ▼紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在A280有最大吸收。特点：简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。 ▼双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应。优点：快速.缺点：灵敏度差 ▼酚试剂（Folin-酚）测定法： 繁琐，但灵敏度、准确度高。 ▼染料结合法（考马斯亮蓝染色法）：又称Bradford法，灵敏、简便、快速、干扰少，是常用的检测法。 ★ * 3 酶的纯化指标 纯度 提纯倍数 回收率 常用比活力表示酶的纯度： 酶活力（u/ml） 比活力＝——————————— 蛋白质含量（mg蛋白/ml酶液） 比活力越高，酶纯度也越好。 ★ * 提纯倍数=提纯后比活力/提纯前比活力 提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。 回收率＝提纯后酶总活力/提纯前酶总活力×100％ 表示提纯过程中酶损失程度的大小。 回收率越高，损失越小。 总活力＝酶活力单位数 ? 酶液总体积 即样品中全部酶活力。 ★ * 判断一个分离纯化方法的优劣，常用总活力的回收率和比活力的提纯倍数两个指标。 回收率：反映酶的损失情况。 提纯倍数：表示方法的有效程度。 一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍数也较大。 ★ * 4 纯化表 ★ 提纯倍数: 0.6/0.416=1.44 9.8/0.416=23.6 500/0.416=1200 比活力: 5/12=0.416 11/3=3.67 364/7=52 总活力: 5×1000=5000 170×10=1700 产率(回收率): 4800/5000=96% 1820/5000=36.4% 1500/5000=30% 酶浓度: 5000/1000=5 1820 /5=364 1700/10=170 * * * * * 思考题： 1 PAGE 和 SDS－PAGE电泳的原理有何区别?应用有何不同? 酶活