重症急性胰腺炎大鼠肾损伤中TLR2-4mRNA表达.docVIP

重症急性胰腺炎大鼠肾损伤中TLR2/4mRNA表达摘要：目的：研究重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）肾损伤中Toll样受体(Toll—like receptor，TLR2/4mRNA)表达的变化及意义。方法：采用逆行胰胆管牛磺胆酸钠(Sodium taurocholate，STC)注射建立SAP肾损伤动物模型，假手术组采用同剂量的生理盐水逆行胰胆管注射。40只雄性SD大鼠随机分为假手术组(n=10，S组)和重症急性胰腺炎肾损伤组(n=30，P组)。S组在术后6小时剖杀动物；P组分别在术后3小时、6小时和12小时三个时间点分批剖杀10只SD大鼠，两组对象分别检测SD大鼠血清淀粉酶、尿素氮、肌酐水平的变化以及肾组织TLR2和TLR4mRNA表达的变化。结果：P组血清淀粉酶、尿素氮和肌酐水平均高于S组(P＜0.05)，且P组分别在术后不同时间点测得的值随时间推移逐渐升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，肾损伤更严重。肾组织TLR2和TLR4mRNA在S组仅有低表达，在P组3点表达开始增高，术后12点该两指标表达达到峰值(P＜0.05）。结论：重症急性胰腺炎时，肾组织内TLR2和TLR4的基因的表达上调；肾组织内该两种基因表达增高可能在SAP肾损伤的发生、发展中起作用。 关键词：胰腺炎 肾损伤 TOLL样受体 【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879(2012)03-0045-02 重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一种病死率较高的常见的腹部外科急腹症，可引起肺、肾、肝等重要多脏器功能障碍，甚至死亡。据研究报道，SAP的发生与Toll样受体2/4 (Toll—like receptor 2/4，TLR2/4)密切相关［1-2］，TLR2/4mRNA与SAP所致肝、肺损伤均进行了初步研究并证实有一定的关联性，TLR2/4mRNA是否与SAP所致肾损伤也有关联尚未阐明，本实验就此进行初步研究。 1 材料与方法 1.1 材料。动物模型制备。雄性健康SD大鼠40只随机分为胰腺炎组和假手术组，实验前大鼠禁食不禁水12h。胰腺炎组（n=30只）采用5％牛磺胆酸钠(TAC)逆行胰胆管注射制造动物模型；假手术组（n=10只）麻醉后用同剂量生理盐水逆行胰胆管注射，其余步骤同手术组。 1.2 研究方法。 1.2.1 标本采集。以上各组均于术后3，6，12时三个时间杀动物，留取静脉血（储存于4℃）和肾组织标本（储存于-70℃）待测。血清标本采用生化自动分析仪测血清淀粉酶、尿素氮和肌酐；肾组织标本采用RT-PCR检测肾组织TLR2和TLR4mRNA。 1.2.2 主要仪器和试剂。全自动生化分析仪（北京奥普森公司），牛磺胆酸钠(TAC)（上海佳和生物科技有限公司），PCR仪（美国ABI公司）,血清淀粉酶试剂盒，RT-PCR检测试剂盒（上海劲马生物科技有限公司），TLR2/4引物（上海生工有限公司提供） 1.2.3 TLR2和TLR4mRNA的检测。无菌留取肾组织约50mg，以Trizol一步法提取细胞总RNA,采用荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对逆转录一扩增产物进行定量分析。 TLR2引物序列： Forward primer：5′-CGCTTCCTGAACTGTCC-3′ Reverse primer：5′-GGTTGTCACCTGCTCCA-3 ′ 扩增片段约为200bp；荧光探针序列为5′-ACTAAGAGGCGGAGCGGA-3′。TLR2扩增循环条件：95℃,3min；（95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s）40个循环；72℃ 8min。 TLR4引物序列： Forward primer：5′-ATCATGGCATTGTTCCTCCT-3′ Reverse primer：5′-CTGAGATTCTGATCCATGCATIG-3′ 扩增片段约为100 bp；荧光探针的序列为5-TCGGTAACGACGGTGTAG-3’。TLR4扩增循环条件：95℃,5min；（95℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s）40个循环；72℃ 8min。 1.3 统计学分析。实验数据均以均值±标准差（X±S）表示；多组数据之间组间比较采用LSD-t检验或方差分析，组内比较采用SNK-q检验，采用SPSS12.0软件进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 两组对象血清淀粉酶、尿素氮和肌酐比较 P组与S组比较，以及P组中3h，6h，12h三个时间组内比较，血清淀粉酶(tsp3h=16.6，tsp6h=116,tsp12h