低分子量透明质酸增强HAV抗原诱导的小鼠体液免疫应答的研究.doc

　　低分子量透明质酸增强HAV抗原诱导的小鼠体液免疫应答的研究 ：舒晓明, 胡凝珠, 兰芸, 陶里, 陈阳, 罗爱华, 胡云章 【摘要】 　　目的: 研究内源性危险信号分子低分子量透明质酸作为天然佐剂对HAV抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法: 将ICR小鼠分成9组, 分别设生理盐水对照组、 HAV抗原组、 HAV抗原+铝佐剂组、 HAV抗原+低分子量透明质酸50 μg组、 HAV抗原+低分子量透明质酸100 μg、 HAV抗原+低分子量透明质酸200 μg、 HAV抗原+低分子量透明质酸300 μg、 HAV抗原+低分子量透明质酸500 μg、 HAV抗原+低分子量透明质酸1 mg组, 皮下免疫小鼠。分别在4、 8、 12 、 16周用ELISA法检测小鼠血清抗HAV IgG水平。结果: （1）空白对照组在4、 8、 12 和16周未见抗HAV IgG产生; 各实验组抗HAV IgG水平在8周时达到最高; 12周和16周时各免疫组的抗HAV IgG水平逐渐下降, 尤以铝佐剂组下降明显; （2）与HAV抗原组相比, 低分子量透明质酸各免疫组小鼠血清抗HAV IgG水平明显升高（Plt;0.05）; 与铝佐剂组相比, 低分子量透明质酸免疫组明显增强特异性抗HAV IgG水平（Plt;0.05或Pgt;0.05）; （3）低分子量透明质酸安全无毒, 无过敏反应。结论: 低分子量透明质酸能够明显增强灭活HAV抗原的体液免疫应答, 具有强的免疫佐剂作用。其免疫佐剂效应优于铝佐剂。 【关键词】 透明质酸 危险信号 佐剂 　　免疫佐剂对辅助抗原诱导机体产生持久高水平的免疫应答十分重要[1], 透明质酸（hyalouronan acid, HA）是从动物组织提取的一种黏多糖, 由（1β4）D葡糖醛酸和（1 β3）N乙酰基D氨基葡糖双糖单位重复连接组成。透明质酸是细胞外基质的重要成分而广泛分布于细胞外基质, 它是构成皮肤、 玻璃体、 关节滑液和软骨组织的重要成分, 具有独特的理化性质和生物学功能。近年研究表明, 低分子量透明质酸是免疫系统的一种重要内源性危险信号, 与TLR2作用后, 以依赖于MyD88、 IL1R相关激酶、 TNFR相关因子6、 蛋白激酶Cζ、 NFκB的方式进行信号传导, 激活机体的天然免疫应答[2]。因此我们推测低分子量透明质酸可能具有免疫佐剂的特性。本研究中以低分子量透明质酸作为疫苗佐剂, 与HAV抗原混合后皮下免疫接种小鼠, 观察内源性危险信号分子低分子量透明质酸对HAV抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响, 以探讨低分子量透明质酸作为疫苗佐剂的可行性。 　　 1 材料和方法 　　1.1 材料 ICR健康小鼠(SPF级, 雌性, 6～8周龄, 质量18～20 g), 由 中国 医学 科学 院北京协和医学院医学生物学研究所灵长类实验动物中心提供, 并按实验动物中心的方法饲养。酶标仪（BioRAD Microplate reader Model 550）购自美国BioRAD公司。抗HAV IgG ELISA检测试剂盒购自KPL公司, 酶标板购自美国eBioscienc公司。灭活HAV抗原和Al(OH)3佐剂均由本室保存。低分子量透明质酸（相对分子量（Mr）为10000以下）购自江苏镇江东元生物科技有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 低分子量透明质酸的制备 用 电子 天平称取适量低分子量透明质酸, 用蒸馏水溶解配制成浓度为5 μg/L。 　　1.2.2 免疫动物 将ICR雌性小鼠随机分成9组, 分别设生理盐水空白对照组、 HAV抗原200 μg免疫组（HAV）、 HAV抗原200 μg+300 μg铝佐剂免疫组（HAVAL）、 HAV抗原200 μg+50 μg透明质酸免疫组（HAVHA1）、 HAV抗原200 μg +100 μg透明质酸免疫组（HAVHA2）、 HAV抗原200 μg +200μg透明质酸免疫组（HAVHA3）、 HAV抗原200μg +300μg透明质酸免疫组（HAVHA4）、 HAV抗原200 μg +500 μg透明质酸免疫组（HAVHA5）和HAV抗原200 μg +1 mg透明质酸免疫组（HAVHA6）, 每组6只。免疫途径为皮下免疫, 共免疫1次。 　　1.2.3 血清抗HAV IgG水平检测 分别于免疫后4、 8、 12和16周对小鼠尾静脉采血, 血样37℃放置1 h后, 4℃过夜, 分离血清, 用ELISA试剂盒检测抗HAV的特异性IgG水平, 具体操作方法按照试剂盒说明书。 　　1.2.4 低分子量透明质酸安全性检测 （1）低分子量透明质酸的异常毒性试验: 实验组选用ICR小鼠10只, 雌雄各1半, 每只小鼠皮下注射5 mg低分子量透明质