应用流式细胞术检测17β雌二醇对H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡的保护作用.doc

　　应用流式细胞术检测17β雌二醇对H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡的保护作用 ：贾国荣，俞小瑞，李红波，王淑红，韩燕 【摘要】 目的 用流式细胞技术(FACS)检测H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡以及17β雌二醇(βE2)对细胞的保护作用。方法 取新生24h内的SD大鼠进行视网膜神经细胞的原代培养，待细胞培养4-5d，经不同因素处理后，用MTT法检测细胞存活率，用FACS法检测细胞凋亡率。结果 200μmol/L的H2O2能有效诱导视网膜神经细胞凋亡；低浓度的H2O2不能诱导细胞凋亡，但高浓度的H2O2诱导细胞凋亡的同时也导致了正常细胞比率的锐减；10μmol/L的βE2能有效对抗H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡；低浓度的βE2对细胞未表现出保护作用，高浓度的βE2对细胞反而表现出毒性作用。结论 一定浓度的βE2在一定范围内能对抗H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡，表现对神经细胞保护的作用。 【关键词】 17β雌二醇；H2O2；视网膜；凋亡；神经保护作用 　　 　　ABSTRACT: Objective To observe H2O2induced neuronal cell apoptosis and neuroprotection of 17βE2 by the technique of FACS. Methods The primary retina neuronal cells of neonatal SD rats ethod and the cell apoptosis by FACS method, respectively. Results H2O2 treatment (200μmol/L) could effectively induce the cultured primary retina neuron cell apoptosis. The loent could induce cell apoptosis, at the same time leading to normal cell decrease sharply; βE2 treatment (10μmol/L) shoary cultured retina neuron cells, but the loanifested toxic action on the cells. Conclusion The limited concentration of βE2 shoary retina cells. 　　KEY TT法测定细胞存活率，用FACS法测定细胞凋亡率，检测H2O2诱导凋亡的最佳浓度及雌激素的最佳保护浓度和预处理时间，为进一步研究雌激素在视网膜组织中的作用机制建立理想的研究模型。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂及仪器 17β雌二醇购于Sigma公司，DMEM/F12培养液购于Hyclone公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，多聚赖氨酸购于华美生物工程有限公司，H2O2购于西安试剂厂，胰酶、DMSO和MTT均购于Ameresco公司，Annexin VFITC/PI购于晶美生物工程有限公司，24孔板购于Costar公司，二氧化碳培养箱(型号为forma 3110 seriesⅡ系列)及全波长酶标仪(型号为1500)均购于Thermo Electron Corporation，流式细胞仪购于美国Becton Dickinson公司(型号规格为FACS Calibur)。 　　1.2 原代视网膜神经细胞的培养 取10只新生24h内的SD大鼠，用75%(体积分数)的医用酒精溺死，超净台内无菌条件下摘取眼球，解剖显微镜下剥离视网膜组织，浸泡于DMEM/F12培养液中。将获得的视网膜组织吹打呈小碎块，用2.5g/L胰酶消化10min，200目筛网过滤，1000r/min离心5min，用含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬细胞，倒置显微镜下细胞计数，调整细胞浓度为1×106个/mL，以1000μL/孔的量接种到铺有多聚赖氨酸的24孔板内，37℃，5%(体积分数)的二氧化碳培养箱培养。每隔24h给细胞做全量换液处理，在细胞培养的第4-5天后，用于试验研究。 　　1.3 MTT法检测细胞的存活率 原代培养的视网膜神经细胞，经不同因素干预之后，24孔板各孔中培养液终体积均为1000μL。向板内的各个孔中均加入浓度为5g/L的MTT 100μL，继续在37℃、5%(体积分数)的二氧化碳培养箱中培养4h后，小心吸弃孔内的全部液体，注意不要将孔底形成的颗粒吸掉，然后每孔加入750μL的DMSO，37℃摇床振荡10min，全波长酶标仪检测490nm波长处的A值。各实验组A值除以PBS对照组A值，再