抗PTDbcr-abl单克隆抗体的制备及鉴定.doc

　　抗PTDbcr/abl单克隆抗体的制备及鉴定 【关键词】 PTDbcr abl融合蛋白 单克隆抗体 制备 PTDbcr/abl是一种利用基因工程合成的融合蛋白［1, 2］。其中PTD（蛋白转导结构域）是人类免疫缺陷病毒（HIV）1所编码的反式激活蛋白TAT的一段多肽片段, 具有独特的跨膜转运方式, 其特点是转导速度快, 效率高。SchAb特异性强, 效价高, 可用于PTDcr/abl融合蛋白的进一步研究。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　大肠杆菌BL21购自Navagene公司。表达PTDbcr/abl融合蛋白的质粒pET16bPTDbcr/abl、 HL60、 K562细胞株由本室构建保存; BALB/c小鼠由第四军医大学实验动物中心提供; 免疫组化试剂盒(链亲和素抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化超敏试剂盒)购自迈新公司; 小鼠IgG亚类快速定性试纸购于法国Argen公司; HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体(由华美生物提供); 免疫球蛋白标准亚类试剂购自Sigma公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 PTDbcr/abl融合蛋白的表达与纯化 　　质粒pET16bPTD与质粒pET16bPTDbcr/abl的制备按照 文献 ［1］进行。用pET16bPTDbcr/abl转化大肠杆菌BL21, 取阳性克隆培养扩增, 用IPTG进行诱导表达后收集菌体, PBS悬浮, 超声裂菌, 并用8 mol/L脲溶解蛋白, 用8mol/L脲（pH值分别是8.0、 6.3、 5.9、 4.5）在NiNTAagarose柱上对蛋白进行亲和层析。收集pH为4.5及5.9的洗脱液, 用4 mol/L脲、 2mol/L脲、 1×PBS/1 mol/L NaCl、 1×PBS/0.5 mol/L NaCl、 1×PBS进行透析后冻干。从中取10 mg干粉溶于2 mL三蒸水中, 取20 μL, 加入 20 μL loading buffer, 100℃煮沸10 min, 进行120 g/L SDSPAGE电泳, 成为蛋白胶。 　　1.2.2 小鼠免疫 　　按 参考 文献［4］进行。取蛋白胶（含蛋白1‰） 40 mg与125 μL完全福氏佐剂, 125 μL PBS充分研磨后, 背部皮下多点注 射免疫BALB/c 小鼠。2周后用蛋白胶（含蛋白1‰） 40 mg与125 μL不完全福氏佐剂, 125 μL PBS充分研磨后, 皮下多点注射, 连续3次, 每次间隔2周, 第3次免疫后14 d, 用PTDbcr/abl 纯化蛋白50 μg/500 μL小鼠腹腔注射, 加强免疫1次, 3 d后取小鼠脾脏待用。 　　1.2.3 细胞融合 　　取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按10∶1的比例, 在500 g/L(L/L CO2孵箱培养, 7 d后改用HT培养基培养。 　　1.2.4 阳性克隆筛选及克隆化培养 　　采用间接ELISA法做交叉筛选。将PTDbcr/abl融合蛋白和HisTaxreb107(另一带有His标签的蛋白, 文章另发)(对照孔)稀释为10 mg/L, 包被96孔酶标板, 100 μL/每孔, 4℃包被过夜, 次日用10 g/L BSA 120 μL/孔封闭后, 分别取待测杂交瘤上清液100 μL加入PTDbcr/abl融合蛋白和HisTaxreb107包被板中, 4℃过夜; 用PBSTol/L H2SO4终止反应。置酶标仪450 nm波长测量A值, A450值大于阴性对照孔2.1倍以上为阳性, 选取PTDbcr/abl融合蛋白阳性而HisTaxreb107阴性的孔细胞, 采用有限稀释法进行亚克隆, 至所有杂交瘤上清液均呈阳性为建株标准。 　　1.2.5 mAb的制备及纯化 　　每只BALB/c小鼠腹腔内注入0.5 mL液体石蜡, 1周后将阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内, 5×106杂交瘤细胞/只。大约7～10 d后收集腹水, 按常规经饱和硫酸铵盐析、 ProteinG亲和层析进行纯化。用紫外分光光度法测定其浓度, 加入终浓度为0.1 g/L叠氮 钠防腐, 直接分装, -20℃保存。 　　1.2.6 mAb的效价测定 　　以PTDbcr/abl融合蛋白为包被抗原, 包板方法同上, 将纯化抗体作4倍比稀释, 按ELISA法常规测定其A450值, 以测定孔A450值≥阴性孔A450值2.1倍为阳性, 计算 其效价。 　　1.2.7 mAb亚类鉴定 　　1.2.9 细胞免疫组织化学染色检测 　　制备含PTDbcr/abl融合蛋白的HL60、 K562细胞方法见 参考 文献 ［1］。取细胞HL60、 K562及含PTDbcr/abl融合蛋白的HL60、 K562各5×105