死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化特异性PCR法的建立与初步应用.doc

　　死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化特异性PCR法的建立与初步应用 ：王雅丽 姚冬明 林江 钱军 许文荣 钱震 朱照辉 肖高飞 吴朝阳 蒋鹏程 【摘要】 目的： 建立甲基化特异性PCR（MSP）技术检测死亡相关蛋白激酶（DAPK）基因启动子甲基化。方法： 设计针对DAPK基因启动子的MSP引物，建立MSP检测体系对甲基化阳性模板进行检测，评价其特异性、重复性和灵敏性，并经测序鉴定。结果： 所建立的甲基化MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板，不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板；对不同梯度稀释的甲基化阳性模板进行检测，其最大敏感性可达2％；在不同时间进行甲基化MSP检测的结果均一致。结论： 成功建立的DAPK基因启动子甲基化MSP检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性，可用于肿瘤标本的批量检测。 【关键词】 死亡相关蛋白激酶; 甲基化特异性PCR; 甲基化 ［Abstract］ Objective: To establish the methylationspecific PCR(MSP) for the detection of promoter methylation of deathassociated protein kinase(DAPK) gene.Methods： The primers of MSP aiming at the DAPK promoter ethylation positive DNA templates.The specificity, sensibility and repeatability ethylated MSP could only amplify the methylation positive DNA template, but not the unmethylated DNA template and unmodified DNA template.In a series of dilution, methylated MSP could detect 2% methylation positive DNA templates.The amplified results of same sample e. Conclusion： The methylated MSP technique for detecting of DAPK methylation ples from cancer patients. ［Key ethylationspecific PCR; methylation 死亡相关蛋白激酶(deathassociated protein kinase, DAPK)是一种相对分子质量为160 kDa的钙调蛋白依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，DAPK是一种正性细胞凋亡调节因子，作为抑癌基因通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡，动物模型研究发现DAPK能够在肿瘤发育的早期阶段抑制细胞转化、并且能够抑制晚期转移事件［1］。近年来对造血系统肿瘤的研究揭示伯基特淋巴瘤（BL）、滤泡性淋巴瘤（FL）、弥漫大B细胞性淋巴瘤（DLBCL）［2,3］、急性髓细胞白血病（AML）、骨髓增生异常综合征（MDS）［4］、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）［5］同样存在着较高频率的DAPK基因启动子甲基化。此外，研究发现DAPK基因启动子异常甲基化与消化道、泌尿道、头颈部、呼吸道肿瘤的发生 发展 密切相关。为此我们建立了甲基化MSP技术对DAPK基因启动子甲基化进行检测，证实其具有良好的重复性、敏感性和特异性，可用于临床肿瘤标本的批量检测。 1 材料和方法 1.1 材 料 1.1.1 研究对象 5例正常人DNA来自我院体检正常人的外周血，5例正常骨髓取自血象正常的胸外科良性肿瘤患者的肋骨骨髓，10例MM患者骨髓来自我院血液科住院患者；甲基化和未甲基化阳性对照分别为经CpG甲基转移酶（M.SssI）处理后再行重硫酸盐修饰的正常人外周血DNA和不经M.SssI处理直接行重硫酸盐修饰的正常人外周血DNA，去离子水作为阴性对照。 1.1.2 主要试剂 基因组DNA 提取试剂盒（Gentra公司）；DNA 修饰试剂盒（Chemicon公司）；热启动酶（Takara公司）；PGEMT克隆载体、T4 DNA连接酶（Promega公司）；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep质粒DNA试剂盒（Axygen公司）； PCR引物均由上海基康生物工程技术服务有限公司合成。 1.1.3 主要仪器 PE9600 PCR仪（ABI公司，美国）；iCycler梯度PCR仪（伯乐公司，美国）； Gene Genius凝胶成像仪（Syngene公司，英国）。 1.2