荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素培养基优化实验.docVIP

荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的培养基优化实验* 摘 要 对荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的培养基组成进行优化研究,结果表明,荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的最优培养基组成为:柠檬酸钠319 g、NH4Cl 014 g、KH2PO41136 g、酵母膏011 g、无水MgSO4013 g、FeSO49mg、蒸馏水1 000 mL,pH 714。该配方在30e,500 lx光照下,类胡萝卜素的产量为1107 mg/g菌体湿重,较优化前产量的0145 mg/g(菌体湿重)提高了1倍多,而培养基成分减少了6种。 关键词 光合细菌,培养基,优化,类胡萝卜素 类胡萝卜素(carotenoids)是四萜类化合物,普遍存在于动 物、植物、真菌、藻类和细菌中,含有呈黄色、橙红色或红色的 色素。除可预防VA缺乏症外,还具有抗癌、抗心血管病、抗白 内障等功能[1]。目前已被国际权威机构FAO和WHO等国 际组织认定为A类营养色素,并在50多个国家和地区获准作 为营养、着色双重功能的食品添加剂。 近年来,采用微生物发酵提取类胡萝卜素的研究已经有 一些报道,比如红酵母、三孢布拉式霉菌、胶质红假单胞菌等。 但是对荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的研究,国内未见报道。 文中以荚膜红假单胞菌为材料,以经典的培养基为基础, 研究培养基组成对菌体生长和类胡萝卜素产量的影响,进行培 养基优化实验,为光合细菌类胡萝卜素色素研制做基础工作。 1 材料与方法 111 光合细菌 荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulatus),本研究 室选育保存菌种。 112 光合细菌全成分培养基 乙酸钠310 g,NaCl 110 g,(NH4)2SO4013 g,MgSO4012 g,CaCl250 mg,酵母膏011 g,MgSO4215 mg,蛋白胨10 mg, KH2PO4015 g,K2HPO4013 g,FeSO45 mg,谷氨酸012 mg,蒸 馏水1 000 mL,pH 714。 113 主要仪器设备 JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有 限公司)、BECKMAN Allegra 64R高速冷冻离心机、岛津UV- 1700全波长扫描仪、SP-1105型紫外可见光分光光度计(上海 光谱仪器有限公司)、生化培养箱(广东省医疗器械厂)、Model JD)3光强测定仪(上海市嘉定学联仪表厂)、奥立龙Model 868 pH计。 114 光合细菌培养方法 将保藏菌种接入液体培养基,在(30?015)e,500 lx下 静置培养30h,然后以10%的接种量将菌液移接到装有200 mL发酵培养基的三角瓶中,同上述条件培养。实验中采用稳 压电源来减少光照强度的波动。 115 培养基优化方法 以光合细菌全成分培养基为基础,通过固定其他成分,分 别改变培养基中的碳源、氮源等形成新的配方,并采用正交设 计等方案研究新培养基对菌体生长( OD660 nm)和色素生成 (OD484 nm)的影响。 116 类胡萝卜素的提取 光合细菌发酵液在4 800 r/min下离心15 min,去掉上清 液后用生理盐水洗涤菌体并再次离心,反复3次,得湿菌体。 湿菌体中加入体积比为8B1的丙酮、甲醇溶液,采用超声波法 破碎细胞(破碎功率200 W,时间8 min)。破碎液放置1 h后 在9 000 r/min下离心10 min得粗提取液。向其中加入等体 积的10%的NaOH-甲醇溶液,混和液在分液漏斗中摇匀并静 置皂化2~3 min,然后继续加入跟粗提取液等体积的石油醚 溶剂,振荡并静置1 min后弃去下层溶液,蒸馏水冲洗石油醚 层,直至清亮为止,得到纯类胡萝卜素的石油醚溶液。 117 类胡萝卜素鉴定 硫酸显色反应[2]:将纯色素的CH3Cl溶液倒入装有浓 H2SO4的试管中,在两相交接处观察颜色的变化。 118 类胡萝卜素含量计算[3] 类胡萝卜素提取液没有浑浊且在没有其他非类胡萝卜素 色素的干扰下,其大致含量可以使用下列公式计算: 总胡萝卜素含量(mg)=光密度值(最大吸收峰的波长下 的OD值)@总体积(mL)@稀释倍数@10A2500 2 结果与讨论 211 荚膜红假单胞菌类胡萝卜素的提取及鉴定 21111 荚膜红假单胞菌菌体生长与色素生成曲线 以全成分培养基为基础,测定荚膜红假单胞菌菌体生长 (OD660nm)和色素生成(OD484nm)的曲线。结果(图1)表明,菌 体生长与色素生成呈同步关系。为此,后续的研究多采用色 素OD484 nm曲线进行探讨。 21112 类胡萝卜素的鉴定 将提取到色素的石油醚溶液倾入装有浓H2SO4的试管 中,两相交接处呈现蓝色,说明有类胡萝卜素存在。 212 荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的培养基优化 类胡萝卜素发酵是一个复杂的生理生化过程,