等位基因特异性PCR技术在DEL表型基因分型中的应用.docVIP

　　等位基因特异性PCR技术在DEL表型基因分型中的应用 【摘要】 目的： 建立DEL表型的基因分型方法，用于快速鉴定DEL表型。方法： 用RH Box基因分型方法鉴定标本的基因型，用血清学方法确定标本的DEL表型。根据RHD 1227A等位基因序列设计等位基因特异性聚合酶链反应(allele specificpolymerase chain reaction,ASPCR)，用于DEL表型基因分型，结果同血清学的方法作比较，探讨临床应用的可行性。结果： 28例RH Box基因分型为RHD-/RHD-的标本，血清学方法、基因分型方法DEL表型鉴定结果均为阴性;在25例RH Box基因分型为RHD+/RHD-或RHD+/RHD+的标本中，用血清学方法检出的11例DEL表型标本，基因分型方法均扩增到867 bp的1227A等位基因条带;1例血清学方法阴性，而基因分型方法检测为阳性，后经测序分析证实RHD 1227A为阳性，分析此例标本可能为血清学方法漏检。这说明在鉴定DEL表型的方法中基因分型方法比血清学有更高的灵敏度。结论： ASPCR方法可用于临床筛选Rh阴性人群中的DEL表型。 【关键词】 Rh血型 DEL表型; RHD 1227A等位基因; 基因分型 　　[Abstract] Objective: To establish a genotyping method for DEL phenotype of human blood group system.Methods： The genotype ined by using genotyping method of RH Box, and DEL phenotype ined by serological method. An allelespecific polymerase chain reaction(ASPCR) ethod ethod, the feasibility of the genotyping method in clinical practices ples ethod and genotyping method for DEL phenotype. In 25 RHD+/RHD- and RHD+/RHD+ samples, 11 DEL phenotype positive samples ethod. Hople ethod for DEL genotype. This sample ined positive by sequencing analysis. Genotyping method for DEL phenotype had higher sensitivity than serological method. Conclusion： The ASPCR method can be used for screening DEL phenotype among the population negative of RHD antigen. 　　[Key l，EDTANa2抗凝，采用试剂盒提取全血DNA(EZBDC血液基因组DNA快提试剂盒,济南泰天和生物科技有限公司)，分装-80℃保存备用。 　　1.4 RHD基因分型 　　采用RH Box基因分型试剂盒(GT，美国)PCR反应总体积9 μl，含7 μl PCR引物混合液，1 μl DNA样品，1 μl Taq酶(含0.33～0.5单位)。PCR扩增条件：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环后置72℃再延长5 min。使用0.5×TBE缓冲液，配制2%琼脂糖凝胶，以10 V/cm电泳30 min，结果通过凝胶成像仪(FR200A全自动紫外与可见分析装置,上海复日科技)拍照成像。 　　1.5 RHD 1227A基因分型 　　采用吴俊杰等[5]的方法根据RHD基因和RHD 1227A等位基因相关序列设计一组特异性扩增RHD 1227A等位基因的引物(上海生工生物技术公司合成)。RHDels:5′GACCAAGTTTTCTGGAAA3′(位置对应于AJ299028的6885)，RHDela:5′CGAGAGAATTTTGAGCAC3′( 位置对应于AB035185的849832)。一对特异扩增人GAPDH基因240 bp的引物作为内对照，GAPDHF:5′TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG3′，GAPDHR:5′TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT3′。总反应体积为10 μl，含模板DNA 0.2 μl，特异性引物终浓度250 nmol/L，内对照引物终浓度50 nmol/L，MgCl