粉防己碱诱导宫颈癌细胞凋亡的定性定量研究.doc

　　粉防己碱诱导宫颈癌细胞凋亡的定性定量研究 ：朱克修，李玢，邓卓，袁彩萍，慕建宁，韩晓兵 【摘要】 目的 从定性定量角度探讨粉防己碱诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用。方法 采用MTT法检测不同浓度粉防己碱作用不同时间对人宫颈癌HeLa细胞株的增殖抑制作用。通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡情况。结果 粉防己碱对宫颈癌HeLa细胞具有增殖抑制作用，且呈时间、浓度依赖性。应用流式细胞仪检测到15μmol/L粉防己碱诱导HeLa细胞产生的凋亡率为(51.8±0.97)%，显著高于对照组凋亡率(24.3±1.23)%(Plt;0.05)。通过激光共聚焦显微镜观察，与对照组比较，粉防己碱作用后HeLa细胞具有明显的凋亡形态。结论 粉防己碱能够抑制HeLa细胞的增殖并诱导其凋亡。 【关键词】 粉防己碱；宫颈癌；凋亡； ChinaABSTRACT: Objective To study the effects of tetrandrine on apoptosis of HeLa cervical cancer cells qualitatively and quantitatively. Methods TT assay. The rate of Hela cell apoptosis induced by tetrandrine eter and confocal laser scanning microscope (CLSM). Results Tetrandrine inhibited the proliferation of HeLa cells in dosage- and time-dependent manners. Floetry shool/L, orphology under CLSM. Conclusion Tetrandrine can inhibit proliferation and induce apoptosis of HeLa cervical cancer cells. 　　KEY I1640培养基购自GIBCO公司，粉防己碱(Tet)购自上海友思生物技术有限公司，根据 文献 [7]以双蒸水稀释粉防己碱，配置浓度为0.1mmol/L的粉防己碱储存液(0.1mol/L HCl助溶，0.1mol/L NaOH调整pH值至6.6～6.7)，4℃保存，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Amresco公司，Annexin-FITC凋亡检测试剂盒购自美国Bipec公司，胰蛋白酶，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司。 　　1.2 细胞株和细胞培养 　　宫颈癌HeLa细胞株由西安 交通 大学临床医学研究分子中心提供。常规培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养条件为37℃，50mL/L CO2饱和湿度，待细胞长至80%融合时，2.5g/L胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。 　　1.3 MTT法检测宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制率 　　取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞浓度5×104个/mL，以200μL/孔接种于96孔板，37℃，50mL/L CO2培养箱中培养24h，以粉防己碱终浓度为10、12.5、15、17.5、20、30μmol/L处理细胞。每个浓度设三个平行孔，并同时设阴性对照和空白对照，分别于作用24、48、72h后每孔加入50mg/L的MTT溶液20μL，37℃孵育4h后，终止培养，小心吸去上清，每孔加入150μL DMSO，振荡器震荡10min，使结晶溶解完全，用酶标仪在490nm处测量A值，按以下公式 计算 细胞增殖抑制率：抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%。 　　1.4 实验分组 　　实验分为对照组和处理组。对照组即正常生长的HeLa细胞；处理组即给予粉防己碱处理的Hela细胞。 　　1.5 AnnexinV/PI双染法流式细胞数检测细胞凋亡 　　以0μmol/L，15μmol/L粉防己碱处理细胞24h后，收集细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL。取1mL细胞，2000r/min，4℃，离心10min，弃上清。用预冷的PBS洗涤细胞，400μL 1×Binding Buffer重悬细胞，密度为1×106个/mL。加5μL AnnexinV-FITC，轻柔混匀，在4～8℃避光孵育15min。再加10μL PI，在4～8℃避光孵育5min。于1h内上流式细胞仪检测。 　　1.6 AnnexinV/PI双染法激光共聚焦显微镜观察细胞的形态学变化 　　将对数生长期HeLa细胞以1×105个/mL接种于预先置有盖玻片的无菌6孔板中，终体积为2.5mL。待24h贴壁后，加入粉防己碱，使其在培养基中终浓度为15μmol/L，同时设不加药的对照