维拉帕米联合阿霉素抑制胆管癌细胞的实验研究.doc

　　维拉帕米联合阿霉素抑制胆管癌细胞的实验研究 【摘要】 目的：研究维拉帕米联合阿霉素抑制胆管癌细胞的作用并探讨维拉帕米增强胆管癌细胞对阿霉素敏感性的机制。方法：以体外培养的人胆管癌细胞QBC939为实验模型，分别或联合不同浓度的维拉帕米与阿霉素作用于QBC939，光学显微镜下观察药物作用后QBC939的形态学变化，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、流式细胞术(FCM)进行检测。结果：在阿霉素、阿霉素联合维拉帕米作用48 h后，光镜下观察，胆管癌细胞变圆，体积缩小，细胞内颗粒、空泡增多，有较多细胞从瓶壁脱落，随着药物浓度增大、时间延长，该变化越来越明显；阿霉素对QBC939有增殖抑制作用，呈剂量依赖性；小剂量的维拉帕米(＜10 μg/mL)对QBC939无细胞毒性作用；维拉帕米联合阿霉素作用48 h后使QBC939阻滞于S期，其凋亡率明显升高。结论：维拉帕米联合阿霉素明显抑制QBC939的生长，与细胞内药物浓度的提高而诱导细胞凋亡、干扰细胞生长周期有关。 【关键词】 胆管癌；维拉帕米；阿霉素 胆管癌是于胆管上皮细胞难以治愈的恶性肿瘤。由于胆管癌所处的解剖位置特殊及其向周围组织、血管、神经浸润的特点，手术切除率极低，虽然近年来早期诊断手段和手术技巧不断提高，手术切除率仍然没有超过50％［1］，加上胆管癌对放、化疗均不敏感，因而预后较差。其中胆管癌细胞中化疗药物浓度低及其易产生耐药性是造成胆管癌对化疗不敏感的主要原因，这又与P－糖蛋白的药物外排泵作用有关。近年来研究显示胆管癌的发病率和死亡率逐年上升［2］。根治性手术是胆管癌首选的 治疗 方法［3］。但是手术切除后的远期效果仍不容乐观，欧美国家胆管癌术后5年生存率仅为5％～13％［4］。尽管胆管癌对放疗和化疗不甚敏感，但是以手术为主的综合治疗，对于改善患者远期疗效具有积极的意义，而化疗作为恶性肿瘤的主要治疗手段之一，在胆道肿瘤中的应用中正逐渐受到人们的重视［5，6］。因此，努力寻求有效的化疗药物和化疗方法成为胆管癌治疗方面的研究热点。 　 　1 资料与方法 　　1.1 材料 细胞株：实验所用人胆管癌细胞株QBC939，由第三军医大学西南 医院 肝胆研究中心王曙光教授惠赠。该细胞系于1993年建立，具有较强的致瘤性，多倍体癌细胞比例甚高。主要试剂：DMEM培养基、小牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜、MTT、阿霉素、维拉帕米。主要仪器：Thermo Forma CO2培养箱，梅特勒－托利多AB104－N型 电子 秤，COIC XDS1B倒置显微镜，ZS2型自动板式酶标仪，FACScalibur流式细胞仪。 　　1.2 方法 细胞培养及传代：QBC939在含10％小牛血清的DMEM培养基、37℃和5％CO2及饱和湿度培养箱中培养，当细胞长满瓶底的80％时，以1∶3～1∶5传代，再继续培养，取生长状态良好的细胞用于实验。光镜观察药物作用48 h后胆管癌细胞形态学变化；MTT比色法检测细胞的存活情况。实验重复3次。实验分为对照组、维拉帕米组、阿霉素组、联合作用组。 　　1.3 细胞周期和凋亡测定 将生长状态良好的QBC939接种于6孔板中，加入相应浓度的阿霉素、维拉帕米、阿霉素＋维拉帕米培养，对照组加DMEM培养液，48 h后上机检测。 　　1.4 统计学方法 所有数据以SPSS13.0统计软件包进行处理。计量资料以±s描述，采用两样本t检验和方差分析对数据进行处理。 　 　2 结 果 　　2.1 光镜观察药物作用后胆管癌细胞QBC939形态学改变 正常胆管癌细胞呈梭形、多角形或呈纤维状，呈散在贴壁生长。将阿霉素、维拉帕米联合阿霉素与QBC939共同培养48 h，期间在光镜下连续观察，细胞变圆，体积缩小，细胞内颗粒、空泡增多，有较多细胞从瓶壁脱落，悬浮于培养液中。随着药物浓度增大、时间延长，该变化越来越明显。维拉帕米单独作用组其细胞形态与对照组比较无明显变化。 　　2.2 MTT法检测阿霉素联合维拉帕米对胆管癌细胞QBC939的抑制作用 将阿霉素、维拉帕米、维拉帕米联合阿霉素与QBC939共同培养，作用48 h后用MTT法检测细胞的存活情况。结果见表1、2，阿霉素对QBC939的生长有抑制作用，呈浓度依赖性(P＜0.05)；小剂量维拉帕米(＜10 μg/mL)对QBC939无明显细胞毒作用(P＞0.05)；不同浓度的维拉帕米联合阿霉素对QBC939的抑制率均大于两药单独应用的抑制率，呈浓度依赖性(P＜0.05)。表1 维拉帕米对QBC939的生长抑制作用（略）表2 维拉帕米联合阿霉素对QBC939增殖的影响（略）注：析因设计方差分析，总体P＜0.05，阿霉素组P＜0.05。 　 　3 讨论 本实验观察到不同浓度的阿霉素对QBC939有抑制作用，随着药物浓度的提