基因工程 基因获取和功能研究技术.ppt

基因及产物 获取技术 1.已知基因 酶切, PCR或RT-PCR获得基因; 通过常规分离纯化技术或通过基因工程进行克隆和表达基因产物. 2.未知新基因 RACE 技术 cDNA文库 酵母双杂交* 酵母单杂交* 噬菌体展示技术* cDNA差示显示法 双向电泳+质谱+数据库技术 3.1 RACE 技术 Rapid amplification of cDNA ends 已知基因一端序列, 快速获取另一端序列. 5’ RACE (获取5’序列) 3’ RACE (获取3’序列) 需要合成引物接头(单链DNA), 用RNA ligase将基因(RNA)与引物(DNA)连接. 3’ RACE (非mRNA扩增) 合成两条互补的引物, 序列任意.及一条序列特异的引物 互补引物中一条5’标记 Pi, 通过RNA ligase 将其与RNA连接. 2.3 cDNA文库 cDNA: (1) 将mRNA反转录为双链DNA. (2) 特点: A.稳定; B.无内含子. 二. cDNA文库: (1) 代表了生物体某一器官或者组织mRNA中所含的全部或绝大部分遗传信息. (2) 特点: A.不同的生物, 同一生物不同组织, 同一组织不同发育时间或不同生理状态下, cDNA文库不同; B.建好的cDNA文库的具体的信息未知,仅提供钓取相关目的基因的材料. C.每个克隆不一定是全长基因 cDNA文库建库过程 1.高质量mRNA的制备; 2.反转录生成cDNA 3.与载体分子连接(噬菌体文库) 4.转染(噬菌体的包装) 酵母双杂交法（蛋白－蛋白相互作用） 1.筛选与已知蛋白相互作用的蛋白基因 2.真核生物的转录激活子基本结构 一般有3个功能域（functional domain） DNA结合域（DNA-binding domain）－－DB 转录激活域（transcription-activating domain）--AD 结合其它蛋白或因子的结构域 ３.5 酵母单杂交（核酸-蛋白相互作用） 用于鉴定与特定顺式作用元件（DNA序列）作用的转录调控因子的DNA结合域．或反之． 噬菌体展示技术 蛋白-蛋白相互作用 将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，从而使多肽能够展示在病毒颗粒的表面，展示在噬菌体表面的多肽配体与各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)通过一种被称为淘选的体外选择程序得以快速筛选鉴定。噬菌体展示技术构建的文库容量大，可进行多次“淘选”富集，十分适用于高通量筛选，因此可以广泛应用于蛋白质相互作用分析等方面的研究，也是进行多肽药物筛选的重要手段。 cDNA差示显示法(cDNA-RDA) 仅知道生理功能, 性状,对基因序列一无所知.获得该相关基因的方法. 原理: A.样本(sample)与对照(control)mRNAs被转录成cDNA, 酶切加可PCR扩增接头, 扩增后除去接头,只有样本被加上新接头(可PCR扩增). B. 样本(ss)与过量对照(cc)杂交后, PCR扩增. sc被线形扩增;ss被指数扩增; CC不被扩增. 双向电泳 双向电泳是蛋白质组学中对蛋白质组进行研究的主要分离方法，同时能分离成百上千种蛋白质。蛋白质在第一向根据电荷的不同（等电聚焦），第二向根据分子量的不同进行分离（SDS）。分离后对蛋白质进行染色，根据实际分析情况，分别进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色。扫描后用相关软件（PDQUEST等）进行图谱分析，分析差别点等。双向电泳与质谱技术联用，还可以进一步分析差别点蛋白的特性。 基因 功能研究技术调控元件功能和表达产物的功能 定点突变技术 基因打靶 RNAi技术 转基因过表达技术 报告基因技术 定点突变 1.研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构,功能的影响; 2.改造DNA调控序列,修饰表达载体,引入新的酶切位点. TaKaRa mutation kit 基因打靶(gene targeting) 通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。(反向遗传学) 基因敲除(gene knockout)：定向敲除 基因敲入(gene knockin)：定向替代 基因打靶的必备条件 胚胎干细胞(ES细胞) 能在体外培养，保留发育的全能性 打靶载体 Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase) 基因敲除的基本程序 打靶载体的构建 打靶载体导入ES细胞：重组置换 基因敲除ES细胞注射入胚泡 胚泡