SHP-1基因在曲妥珠单抗致心肌细胞凋亡中的调控作用.pdfVIP

广东医学 2015年 5月 第36卷第9期 GuangdongMedicalJournal May．2015，Vo1．36，No．9 · 1343 · SHP一1基 因在 曲妥珠单抗致心肌细胞凋亡中的 调控作用 吴依芬 ，李荣 ，贾筠 ，罗荣城 广‘东省东莞市人民医院肿瘤内科 (523059)；。南方医科大学南方医院肿瘤内科 (广州 510515)；南方医科大学 中西医结合医院肿瘤中心(广州510315) 【摘要】 目的 初步观察转染SHP一1基因前后大鼠心肌 H9C2细胞对抗曲妥珠单抗的能力，SHP一1蛋白 表达情况及转染SHP一1基因对H9C2细胞增殖能力的影响。方法 构建真核表达载体pcDNA3．1(+)一SHP一1 和pcDNA3．1(+)一SHP一1C／S，利用脂质体转染法转染大 鼠心肌H9C2细胞，经G418筛选阳性克隆，阳性克隆细 胞在曲妥株单抗中维持生长。用Westernblot检测SHP一1基因在大鼠心肌H9C2细胞中的稳定表达情况，并通过 流式细胞学观察细胞凋亡曲线。结果 蛋白水平证实，转染细胞 内有 SHP一1基 因的表达，并且转染pcDNA3．1 (+)一SHP一1的心肌细胞SHP一1表达明显升高，经曲妥珠单抗干预后蛋 白表达量下降。转染pcDNA3．1(+)一 SHP一1后 H9C6细胞在曲妥珠单抗 中凋亡率明显升高(P0．05)。结论 向大鼠心肌H9C2细胞 内转染SHP一1 基 因并使其稳定表达，可以促进大鼠心肌H9C2细胞的在 曲妥珠单抗 中的凋亡，为以后进一步探讨 SHP一1基因 的功能打下了基础 。 【关键词】 SHP一1基因；酪氨酸磷酸酶；曲妥珠单抗；H9C2细胞 SHP一1(SH22ContainingTyrosinePhosphatase1) l 材料与方法 是含有SH2结构域的具有高度保守序列 的蛋 白酪氨 1．1 材料 感受态大肠杆菌 DH5ct、大 鼠心肌细胞 酸磷酸酶亚家族 中的重要成员 ，能与细胞 内磷酸 H9C2株由南方医科大学中医药实验室刘彬赠送，真核 化的酪氨酸特异性结合并催化其去磷酸化 。在心肌 表达载体pcDNA3．1(+)与 目的基 因SHP一1的重组 细胞中RNA干扰SHP～1后可以显著减少心肌细胞凋 子由梁继珍硕士构建。限制性 内切酶 Mscl、EcoRI和 亡 ，表明SHP一1对心肌细胞亦起调控作用。曲妥珠 质粒提取试剂盒购 自Takara公司。T4DNA连接酶购 单抗作为一种针对表皮生长 因子受体 2(epidermal 自鼎国公司，DNA胶 回收纯化试剂盒购 自QIAGEN公 growthfactorreceptor2，HER一2)的重组人源化单克隆 司。Trizol、逆转录酶 Superscriptm、PlatinumTaqDNA 抗体 ，广泛用于治疗 HER一2高表达 的乳腺癌患者和 PolymeraseHighFidelity、RNase抑制剂、PCR试剂，lipo· 胃癌患者。临床观察发现使用曲妥珠单抗有较高的心 fectamine2000购 自Invigogen公司；PCR引物合成由广 功能不全发生率。研究表明，曲妥珠单抗在与乳腺癌组 州英俊公司完成。抗 鼠SHP一1单抗购 自ABcom公 织中HER一2结合的同时，也与心肌细胞上的HER一2 司；抗生素G418、硝酸纤维膜购 自威佳公司。 受体结合，最终导致 Bcl—xL和Bcl～xS失衡而激活线 1．2 方 法 粒体凋亡途径致使心肌细胞凋亡 。另外，曲妥珠单 1．2．1 真核表达载体 pcDNA3．1(+)一SHP一1C／S 抗可以与心肌细胞上的HER一2受体结合内吞并降解 的构建 利用突变 PCR的方法，根据 SHP一1基因编 HER一2，破坏受体的二聚体化，中断下游的信号转导 码区序列设计突变引物，以野生型载体 SHP一1质粒 使心肌细胞凋亡。那么 ，SHP一1对于曲妥珠单抗导致 为模板经行突变，将 SHP一1基 因第453密码子tgc突 的心脏毒性是否具有调节作用 呢?2013年 1O月至 变为 tCc，设计突变引物如下 ：SHP一1一rout上游：5一 2014年 10月，本研究在前期工作