柴胡治疗肝细胞癌的实验性研究.docVIP

柴胡治疗肝细胞癌的实验性研究 摘要： 目的 探讨柴胡对肝细胞癌的治疗作用。 方法 采用H22肝癌荷瘤小鼠模型，在体观察柴胡颗粒对荷瘤小鼠肝癌的抑制率、脾指数、胸腺指数以及外周血白细胞计数、病理组织切片观察等的影响。采用体外培养人肝癌细胞HepG2细胞株，用MTT法检测不同剂量柴胡水煎液对人肝癌细胞HepG2生长的抑制作用，计算细胞存活率。结果 柴胡高剂量明显抑制在体肿瘤的生长，对脾指数、胸腺指数有显著的增高作用，同时柴胡高剂量会抑制肝癌细胞HepG2的生长。 结论 柴胡能有效的抑制肝细胞癌。 关键词：柴胡；肝癌；H22，HepG2；生长抑制 柴胡为伞形科植物柴胡(Bupleurum chinensis DC．)或狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd．)的干燥根，其味苦、性凉，入肝、胆经。具有解表退热，疏肝解郁，升举阳气等功效。现代药理学研究表明柴胡具有抗肿瘤、抗炎、保肝、解热、镇痛、免疫调节等功效。现代医学研究已证明，柴胡对恶性肿瘤的疗效确切。肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均占癌症中的第二位。中药柴胡抗肝癌的作用日益受到重视，为观察柴胡对肝癌的抑制作用及对机体的免疫调节作用，我们通过体外培养人肝癌细胞HepG2细胞株以及接种H22细胞株形成小鼠肝癌移植瘤，用柴胡饮片水煎液进行治疗的方法，以探讨研究其在肝癌治疗中的应用价值。 1 实验材料 1.1 药物 北柴胡颗粒购于福建省人民医院；氟脲嘧啶购于天津金耀氨基酸有限公司。 1.2 动物 实验动物为清洁级健康KM小鼠．雄性，20-22g，许可证号：SCXK(沪)2012-0002 1.3 细胞株 HepG2细胞株细胞株由厦门大学实验室提供，H22细胞株由厦门大学实验动物中心提供。 1.4 实验试剂 生理盐水注射液（广东利泰药业有限公司）；RPMI1640 培养基（GIBICO）；双抗（Hyclone）；胎牛血清（Hyclone）；胰蛋白酶（Hyclone）；二甲基亚砜（EBIO）；台盼蓝（生理教研室赠）；磷酸盐缓冲液（Solarbio）。 1.5 实验仪器 光学显微镜及照相系统（ECLIPSE55I+DXM1200C，日本尼康公司）；倒置显微镜（TE2000-S，日本尼康公司）；相差显微镜（BH-2，日本OLYMPUS公司）；高压蒸汽灭菌器（MLS-3750，日本三洋公司）；超净工作台（SW-CJ-1F，苏州净化设备有限公司）；微量移液器（PIPETTOR，大龙医疗设备）；生物组织石蜡包埋机（YB-TLF，湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司）；生物组织摊烤片机（YT-TFB，湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司）；半自动石蜡切片机（HM340E，德国）；隔水式电热恒温培养箱（WGP-350，上海安亭科学仪器厂）。 2 实验方法 2.1 柴胡对H22荷瘤小鼠的作用研究 2.1.1 实验药物制备 柴胡以饮片生药量计为：3.5mg/mL 7mg/mL 10.5mg/mL 3个剂量 2.1.2 细胞培养 将人肝癌细胞HepG2置于含10%的胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基中，于37℃，5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。取传代数少于20代的对数生长期细胞用于实验。 2.1.3 MTT法检测细胞存活率 细胞培养于含10% FBS的高糖DMEM培养液中，取处于指数生长期HepG2细胞，活细胞率97%，接种于96孔板，每孔1×104个细胞。分为对照组，柴胡10.5mg/mL组，柴胡7mg/mL组，柴胡3.5mg/mL组，阳性对照组5-Fu 125ug/mL，共5组，每组设3个复孔，并设无细胞空白调零孔。细胞铺板过夜后，加入相应药物，5%二氧化碳，37℃培养48小时。弃培养液，PBS温和洗涤3次，加入1mg/mL MTT溶液100uL，37℃温育4小时，小心吸去MTT液，MK2型酶标仪495nm读板测定各组吸光度值(即OD值)，并按下列公式计算，细胞存活率=实验组吸光度值／对照组平均吸光度值X100％。（抑制率=1-细胞存活率） 2.1.4 观察细胞生长情况 细胞悬液10000个/mL，0.5mL/孔接种5000个/孔，接种后1日加药，药物剂量柴胡水煎液10.5mg/mL 7mg/ml，5-Fu 125ug/mL ,及对照组 共4组，取加药后1、2、3、4、5天，进行细胞计数，绘制生长曲线。 2.2 柴胡对人肝癌HepG2细胞的作用研究 2.2.1 药物制备。将浓缩好的北柴胡颗粒配制成浓度为0.2g/ml、0.1g/ml、0.02g/ml的高、中、低3个剂量组，，每日1次，4C冰箱保存，用时水浴加热摇匀。规格为25mg/ml的氟脲嘧啶注射液稀释5mg/ml。 2.2.2 接种 选择腹腔接种H22细胞株