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人牙龈上皮细胞的原代和传代培养* 潘 宣1 周 健1 曾融生2 1广州铁路( 集团) 公司广州铁路中心医院口腔科( 510080) ; 2中山大学光华口腔医学院( 广州510060) 广东医学 2003 年 11 月 第 24 卷第 11 期 1 材料与方法 111 细胞分离与原代培养 拟行阻生牙拔除术患者, 术 前检查排除系统性疾病, 无口腔黏膜疾病, 冠周龈组织无 炎症表现, 术前征得患者同意, 术中无菌状态下切取颊侧 或远中龈组织一块, 约3 mm @ 5 mm, 在手术显微镜下尽 可能去除黏膜下结缔组织, 放入盛有无血清DMEM 培养 液( 美国Gibco 公司) 的青霉素小瓶, 置于低温保温瓶中尽快带回实验室。在实验室超净工作台内取出组织块, PBS 漂洗3 次, 除去血凝块, 放入含青霉素100 u/ ml、链霉素 100 u/ml 的无血清培养液中浸泡漂洗10 min; 含10% 氟 康唑无血清DMEM 培养液冲洗3 次, 剪成1 mm @ 1 mm 小 块后置于消毒的青霉素小瓶中, 加入1 ml 0125%分离酶 ( dispase, 美国Gibco 公司) , 密封置于4 e 冰箱, 16 h 后取 出。在实验室超净工作台内取出组织块, 在解剖显微镜 下使用两把眼科镊把上皮组织与其下的结缔组织完全分 离, 无血清DMEM 培养液轻轻冲洗上皮组织块3 次, 置于 消毒的5 ml 离心管, 加入01125%胰酶( 上海生工公司) 1 ml, 37 e , 轻轻震荡2 min 后, 加含10%胎牛血清(FCS, 美 国HYCLONE 公司) 的培养液2 ml 终止胰酶消化, 吹管轻 轻吹打至形成单细胞悬液。转数800 r/min 离心3 min, 弃上液, 加培养液, 倒置显微镜下计数, 调整细胞浓度为 1 @ 106/ml, 接种于培养瓶中。于37 e , 湿度100%, 5%CO2, 95%空气的培养箱( 美国SHEL- LAB 公司) 中培养, 每2 天换液一次。每天倒置显微镜( 日本OLYMPUS 公 司) 下观察。培养液中主要添加成分及比例为FCS, 10%; penicillin G, 100 u/ml; kanamycin, 011 mg/ml; hydrocortisone, 015 Lg/ml; insulin, 5 Lg/ml; amphotericin B, 0125 Lg/ml。 112 龈上皮细胞的传代培养 原代培养细胞在7~ 10 d 左右开始生长融合成片, 当细胞汇合达80%左右时, 吸出 原含有FCS 的培养液, 加入少量0125%胰蛋白酶, 轻轻震 荡10 s 以中和残余的FCS, 弃去, 再加入0125%胰蛋白酶 1 ml, 37 e , 在倒置显微镜下控制消化时间, 待上皮细胞 收缩变圆时加入含10%FCS 的培养液终止消化, 吸管吹 打至细胞脱落, 形成细胞悬液。按1B2 比例传代培养。 113 原代培养细胞的鉴定 在培养皿中置入消毒的盖 玻片, 同前方法, 细胞分离制成细胞悬液后调整细胞浓度 为5@ 106/ml, 接种于消毒的盖玻片表面, 静置24 h 后, 加 入培养液, 培养箱中培养。在培养后第10 天, 取出生长 有上皮细胞的盖玻片, PBS 液冲洗3 次后, 空气干燥, 丙 酮固定, ABC 法免疫组织化学染色。一抗为1B500 兔抗 人角蛋白多克隆抗体( 美国MAXIM- BIOTECH 公司) , 二 抗为生物素标记的鼠抗兔IgG( 美国MAXIM- BIOTECH 公司) , 第2 层为酶标生物素- 卵白素复合物, DAB 显色, 中性树胶封片。PBS 作空白对照, 成纤维细胞作对照。 114 分离酶作用部位的组织学观察 同前方法, 取一块 正常龈上皮组织, 经分离酶作用16 h 后, 分离上皮组织 与结缔组织, 获得单纯的黏膜上皮组织。将该皮片用 10%福尔马林固定, 石蜡包埋, 切片, 厚度为5 Lm, 分别作 常规HE 染色及角蛋白免疫组织化学染色。对照组取一 块人正常龈上皮组织作常规HE 染色。 第四军医大学博士学位论文 胞浓度为xsl护m/L，取195林L细胞悬液加入5林LAnnxeni-vFITc室温避光孵育10mni， BPs清洗、离心，加入190匹结合缓冲液重悬细胞，加入or匹lm叭PI溶液，使用 ELITEESP型流式细胞仪上样分析。 1.6透射电子显微镜分析 取第2一3代生长良好的细胞，按2又l护/cm，的细胞密度接种于75cmZ培养瓶，标 准条件培养12h待细胞贴壁，按EZ、Cl组换培养液，标准条件下培养48h，消化收集 细胞，冰冻PBs清洗2次，5x103m/rin离心x5min，4%戊二醛固定，脱水，Epon512 树脂包埋，先切半