慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786—0细胞增殖并促进细胞凋亡.pdfVIP

第 33卷 第 5期 中山大学学报 (医学科学版) V01．33 No．5 2012年 9月 JOURNALOFSUNYAT—SENUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES) Sep 2012 慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786一O细胞增殖 并促进细胞凋亡 石 华 1．2，邓军洪 ，郑少斌 ¨，王 铸 ，曹开源 ，周 亮 ，万 华 (1．南方医科大学南方医院泌尿外科 ，广东 广州 510515；2．广州医学院附属广州市第一人民医院泌尿外科， 广东广州510180；3．中山大学临床检验标准化研究中5,／／q~山医学院微生物学教研室，广东广州 510080) 摘 要：【目的】应用慢病毒介导的RNA干扰技术，检测 clnsterin(CLU)基因沉默在人肾癌 786一O细胞的干扰效果及其 对人肾癌 786—0细胞增殖、迁移和凋亡的影响。【方法】构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体，利用包装细胞 293T获得重组 慢病毒 ，感染人。肾癌 786一O细胞株。实验分5组 ：CLU—RNAi—LV1(KD1)、CLU—RNAi—LV2(KD2)、CLU—RNAi—LV3(KD3)为加 入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组，未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组 (NC组)，。肾癌 786一O细胞为空 白对照组 (CON组)。应用 Realtime—PCR及Westernblot检测不同组别干扰前后 CLUmRNA及蛋白表达的变化 。用细胞划痕实验 、 MST一1、流式细胞仪等方法检测 CLU沉默后。肾癌786一O细胞在增殖、迁移、凋亡等生物学行为的改变。 【结果1成功构建 CLUshRNA慢病毒载体 clu—RNAi—LV并获得相应慢病毒。Realtime—PCR显示不同感染复数 CLU—RNAi—LV处理的KD1、 KD2、KD3组CLUmRNA表达水平与对照组相 比分别下调 69．4％～96．5％和 0。Westernblot结果显示 KD1、KD2、KD3组CLU 蛋白表达水平与CON组相比分别下降35．24％、46．26％和58．91％，KD3能显著抑制786一O细胞中CLU基因的表达。划痕实 验显示 24h时 KD3(si—CLU)组细胞迁移相对距离 (408．43±25．92)小于 NC组 (101．35±6．05)和 CON组 (68．13±6．64，P 0．05)。WST一1法检测转染后72hKD3(si—CLU)组细胞生长速度较NC组及 CON组明显下降(P0．05)，各组间差异(P O．05)，均有统计学意义。流式细胞仪检测KD3 (si—CLU)组与 NC组、CON组细胞凋亡率分别为 (6．23±2．51)％、(1．054- 0．30)％和 (1．17±0．29)％，KD3(si—CLU)组与NC组、CON组相比凋亡率增加 (P0．05)，差异有统计学意义。肾癌 786一O细 胞的增殖、迁移受到抑制，而凋亡率增加。【结论】筛选出能稳定干扰 CLU基因表达的siRNA序列和。肾癌786一O细胞株。CLU 慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786一O细胞的内源性CLU基因，抑制肾癌786—0细胞的增殖、迁移并促进细胞凋亡。 关键词：RNA干扰；慢病毒；clusterin；肾细胞癌 ；786一O 中图分类号：R737．11 文献标志码 ：A 文章编号：1672．3554(2012)05—0603—07 Lentivirus-mediatedClusterinSilenceInhibitsProliferationandPromotesApoptosisin HumanRenalCellCancerLine786．O InVitro SHIHua一，DENGJun—hong2，ZHENGShao—bin ，WANGZhu，CAOKai—yuan，ZHOULiang，WANHua (1．DepartmentofUrology，NanfangHospital，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515，China；2．DepartmentofUroloyg， TheFirstPeople’SHospital