实验15 琼脂糖凝胶电泳的原理和方法.pptVIP

（三）结 构 特 征 CM VLDL LDL HDL 甘油三脂 胆固醇 蛋白质 带电量（Q）pH8.6为例 颗粒大小（mm） 密度 电泳速度 形态 多 多 少 少 大 低 慢 规则 不规则 少 少 多 多 小 高 快 pH 8.6 pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。 加样槽 β 前 β α CM LDL VLDL HDL — + 临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM β 前β α 正常 Ⅰ型 Ⅱa型 Ⅱb型 Ⅲ型 Ⅳ型 Ⅴ型 六、操 作 溶 胶 准备胶槽 凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml 铺 胶 凝胶凝固后取出梳子 加缓冲液 准备样品 点 样 电 泳 注意观察溴酚蓝染液的迁移 琼脂糖凝胶中DNA的观察 溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下 红色荧光 紫外灯下观察电泳结果 照 相 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。 实验原理 一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 二、实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样， 注意! 溴化乙锭（EB）为强致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 目前实验室一般用相对安全的GoldenView等核酸荧光染料代替。 * 疏水性较强的甘油三酯及胆固醇酯均位于脂蛋白的内核,载脂蛋白、磷脂及游离胆固醇覆盖于脂蛋白表面，其极性基团朝外。 * 琼脂糖凝胶电泳的 原理和方法 概念：以琼脂糖凝胶作支持体的电泳方式。 一、概述 琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及其它红藻类植物提取出来的藻胶。 1）琼脂糖： 由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。 2）琼脂胶： 一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。 琼脂糖链依靠分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。 D-半乳糖 3,6-脱水-L-半乳糖 琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下： 1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。