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一种富含多糖的关节软骨组织总RNA提取方法初探 刘玉刚，胡 旭，付建军，张 莹，廖通权，周 跃，初同伟 （第三军医大学新桥医院骨科，重庆 400037） 摘 要：目的 探索一种适合富含蛋白多糖的关节软骨组织总RNA提取方法。方法：用一步法、Trizol法、plant RNAout法和一步法结合plant RNAout法4种方法提取了兔膝关节软骨组织的总RNA，对各种方法进行比较分析，并以获得总RNA为模板，用长距离PCR(LD-PCR)的方法合成了双链cDNA并进行了扩增。结果 一步法、Trizol法、plant RNAout法获得的总RNA均含有蛋白多糖污染或DNA污染，不能满足实验需要，用一步法结合plant RNAout法提取的总RNA纯度高、完整性和稳定性好，成功逆转录合成双链cDNA。结论 一步法结合plant RNAout法适合关节软骨组织小量高质量的总RNA的提取。 关键词：关节软骨；RNA提取；LD-PCR 中图分类号： 文献标识码：B 基金项目：国家自然科学基；重庆市自然科学基金（CSTC2006BB5355） Supported by the National Natural Science Foundation of Chinaand the Natural Science Foundation of Chongqing（CSTC2006BB5355） 作者简介：刘玉刚，男，博士研究生，主治医师，主要从事脊柱关节损伤的修复方面的研究。电话E-mail : bear219@126.com 通信作者：初同伟，电话：（023E-mail : Chtw@ 收稿日期：2009-08-20；修回日期：2009-10-20 提取高质量的总RNA合成cDNA是进行基因表达研究的基础。关节软骨组织细胞含量少，细胞的比例约占10%，软骨基质含有大量的蛋白多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，在沉淀RNA时，产生富含多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，在去除多糖的同时RNA也容易被带走，造成RNA得率的减少，因此从关节软骨中提取高质量的RNA有相当的难度[1]。现有的用于提取动物组织细胞总RNA的方法，如一步法、trizol法等，都是基于酸酚/胍原理基础上的，因其对多糖和RNA分离效果差，不适合提取含蛋白多糖丰富的软骨组织。为后续研究关节软骨损伤后的差异表达基因的需要，本实验在参照现有总RNA提取方法的基础上，经过摸索，成功提取出了高质量关节软骨组织总RNA，以此继续进行LD-PCR合成了双链cDNA，解决了关节软骨组织总RNA提取的难题，为后续关节软骨基因表达的研究提供了条件。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 组织来源 实验用材料为新西兰白兔膝关节软骨损伤后修复组织。于2006年11月购买幼年（4周龄）新西兰白兔，通过开放手术用电钻在双侧膝关节股骨关节面造成直径3 mm、深3 mm的损伤模型，损伤后4周处死动物，取损伤部位修复组织及周围2 mm范围软骨组织及软骨下骨组织，立即放入液氮中冷冻保存。 1.1.2 主要试济和仪器 变性液(6 mol/L异硫氰酸胍，37.5 mmol/L柠檬酸三钠，0.75%十二烷基肌氨酸钠)，(-巯基乙醇，氯仿∶异戊醇（49∶1）混合液，2 mol/L 醋酸钠50ml（pH 4.0）, 酸性水饱和酚（pH 4.5,上海生物工程公司），DNA Marker DL1000(大连宝生物公司),Trizol（大连宝生物公司），plant RNAout（绵羊天择基因公司），SMART? PCR cDNA Synthesis Kit（Clontech,USA）。AJ-30I型低温超速离心机（Beckman,USA），Chemilmager 5500型凝胶成像仪（Alpha Innotech,USA），PTC-200型梯度PCR仪（Bio-Rad,USA），DU-800型核酸/蛋白检测仪（Beckman,USA）。 1.2 实验方法 1.2.1 软骨组织总RNA提取 一步法 组织秤量后，按每50 mg加变性液1 ml，7 (l (-巯基乙醇，玻璃匀浆器于冰水浴中匀浆，直至无明显组织块为止。室温静止5 min，将匀浆液分装入无RNase 1.5 ml离心管，每管0.5 ml，每管加500 (l酸性水饱和酚、50(l 2 mol/L 醋酸钠、100 (l氯仿∶异戊醇混合液，min，于4℃，12 000×g，离心10 min。取上清加入无RNase1.5 ml离心管，每管加500 (l氯仿∶异戊醇（49∶1）混合液，g，离心5