实验一：鸡血细胞融合.doc

实验一：鸡血细胞融合 实验目的 熟悉细胞融合的理论； 掌握PEG诱导的细胞融合方法。 实验原理 1、细胞融合原理 两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。 利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,?使两细胞的胞质沟通,?从而造成相互接触的细胞之间发生融合。? 细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合。 2、细胞融合方法 诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。 1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。 2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。 3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 所有的细胞融合方法都有其各自的优缺点，我们在本次实验中采用PEG诱导细胞融合的方法。 三、实验材料和用品 1．材料： 鸡血红细胞； 2．器材和仪器：显微镜、离心机、刻度离心管、试管、载玻片、盖玻片； 3．试剂： Alsever 液(pH7.4)、0.85％生理盐水、GKN 液、50％PEG 四、实验步骤 1、取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4℃下保存）； 取上步中所得悬液1ml+4ml 0.85％的NaCl溶液，进以下三次离心处理： ①1200r/min离心5min（去上清液再加入至5ml的0.85%NaCl溶液）； ②1000-1200r/min离心5min（去上清液再加入至5ml的0.85%NaCl溶液）； ③1000～1200r/min离心7min； 3、将上步最后一次的沉降血球（去上清液后，约0.1-0.2ml），加入GKN液至1-2ml，使之成10%的细胞悬液。 4、取上述10%的血球悬液1ml，加入3ml GKN液，使每毫升含血球15000万个，即15×107个/ml。 5、取步骤4中所得悬液1ml+0.5ml 50%的PEG液，混匀滴片，再常温下2-3min后即可镜下观察。 五、实验结果 图一：鸡血细胞融合现象光镜观察（10×40）融合中有两核的细胞 图二：鸡血细胞融合现象光镜观察（10×40）细胞刚开始融合 六、讨论与结论 聚乙二醇分子能改变各类细胞的生物膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，使细胞发生融合，形成融合细胞。本次实验用聚乙二醇处理鸡红血细胞并制片利用显微镜观察。 由实验图片可得，照片中鸡血红细胞两个或者更多出现不同程度的相互融合，但总体来说融合率并不高的。经分析主要是以下原因： 由于PEG与鸡血红细胞悬浊液接触时间适宜， PEG与鸡血红细胞接触不充分，从而融合率比较低。因为在吹气泡的时候，PEG与鸡血细胞悬浊液混合并不均匀，以至于达到了细胞融合率并不高。