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蛋白酶的盐析沉淀实验报告 班级：生工1005 学号：0203100520 姓名：朱同辉 实验目的： 1.掌握使蛋白质胶体溶液保持稳定的因素； 2.了解蛋白质沉淀的几种方法及其意义； 3.掌握测定蛋白酶活力的原理和方法； 4.学习酶活力的计算方法。 实验原理： 盐析法 在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。 原理 ： ①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去除水膜； ②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷，使分子间静电斥力减弱，疏水作用增强，使蛋白质沉淀。 盐析效果： 二价离子 一价离子 离子半径小 离子半径大 阳离子∶Mg2+Ca2+Ba2+NH4+Na+K+Pb+Cs+ 阴离子∶PO43-SO42-Cl-Br-NO3-I-SCN- 蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn经验式来表示： 式中：S—蛋白质的溶解度 I—离子强度 β—常数，与温度和pH有关 Ks—盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关 其中I 根据下式计算： 式中：ci—i 离子的浓度（mol/L） zi—i 离子所带的电荷 蛋白酶活力的测定 福林（Folin）试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量，从而推断酶活力的大小。 蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算 K—在酪氨酸标准曲线上O.D值为l时酪氨酸的微克数（μg），K值为108.53 N—酶液稀释倍数 4—酶反应液为4 ml，取出1 ml测定，故乘以4 10—反应时间为10 min 参考稀释倍数：原酶、饱和度20%，30%，40%，50%，60%，70%的上清液分别为1000，200，150，100，100，100，50倍 实验步骤： 1）蛋白质盐析 分两个大组进行实验，每大组取6只烧杯编号，分别加入50 ml蛋白酶液，分别称量5.70，8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固体硫酸铵粉末（对应20%，30%，40%，50%，60%，70%饱和度），在磁力搅拌器不断搅拌下，将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌5 min，使硫酸铵完全溶解。然后静置使蛋白酶沉淀完全。 将含有沉淀的酶液小心倒入离心管中，在天平上称重平衡，用高速冷冻离心机离心于10℃，10,000 r/min离心20 min。 将上层清液倒入量筒记录其体积，并分别测定酶活（u/ml），即为该酶的溶解度S。 2）蛋白酶活力的测定： 1.将2%酪蛋白溶液40℃预热3-5min 2. 取3支试管编号0、1、2，分别吸取待测酶液1ml放入试管中，40℃水浴中预热1-2min 3.往0号试管加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，再往3支试管中加入2%酪蛋白1ml，计时摇匀，40℃反应10min 4.往1、2号试管中加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，摇匀，取出3支试管静置10min 5. 另取3支试管，分别吸取上述清液1ml，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，于40℃水浴中保温20min显色。 6.以0号管为对照，在波长680nm处测定1、2号管的吸光度，求出平均值。 3）蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算 计算出各种硫酸铵饱和度下的硫酸铵浓度，离子强度，蛋白酶溶解度和上清液酶活残留，并填表。 以log S为纵坐标，I为横坐标作图，将直线部分线性回归，求出Ks和β的数值，建立起蛋白酶的盐析曲线。 数据记录及实验结果： 编号 O.D680 平均值 上清液体积/mL 原酶液 1 0.388 0.406 \ 2 0.424 饱和度20% 1 1.069 1.121 55.8 2 1.173 饱和度30% 1 0.819 0.821 55.4 2 0.823 饱和度40% 1 0.952 0.985 53.0 2 1.018 饱和度50% 1 0.021 0.220 56.2 2 0.418 饱和度60% 1 0.062 0.051 58.5 2 0.040 饱和度70% 1 0.091 0.151 62.1 2 0.211 编号 (NH4)2SO4浓度mol/L 离子强度I 上清液酶活 蛋白酶溶解度S logS 原酶液 0 0 \ \ \ 饱和度20% 0.82 2.46 4866 271522.8 5.43 饱和度30% 1.23 3.69 7128 394891.2 5.59 饱和度40% 1.64 4.92 6414 339942.