邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性.doc

邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究 摘 要：目前超氧化物歧化酶(SOD)活性测定结果混乱，为提高测定结果的可比性, 对邻苯三酚自氧化法测定 SOD 活 性的方法进行了研究，就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH 及所含的 EDTA 量等因素对测定结果的影 响进行了探讨，根据实验结果，提出了新的改良方法. 超氧化物歧化酶(SOD)是一种特殊的金属酶, 它能催化超氧阴离子自由基(O2—)发生歧化反应, 从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基(O2—), 是生物体重要的细胞防御系统之一, 具有防御氧毒、抗辐射、防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效[1]，超氧化物歧化酶(SOD)这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景,激起了人们广泛的研究热情. 自 1969 年 McCord 等首次发现具有活性的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase简称SOD) 以来，众多测定SOD的方法已逐步建立起来，其中以化学法最为常用. 经典的邻苯三酚法是Marklund等[2]于 1974 年发表的一种通过比色测定 SOD 的简便方法. 此后，邻苯三酚法在国内外得以广泛应用. 与其他方法相比，邻苯三酚自氧化法具有操作简便，快速，试剂便宜且用量小，重复性好等优点；但文献报道的邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的测定条件各不相同，这就造成了测定结果的混乱和缺乏可比性. 为此我们对邻苯三酚自氧化法测定 SOD 活性的方法进行了研究，就该测活体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH 及所含的 EDTA 量等因素对测定结果的影响进行了探讨. 1 原理 在碱性条件下, 邻苯三酚迅速氧化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系. SOD 加入邻苯三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧化速率降低，可作为测定 SOD 活性的理论依据. 2 材料与方法（1） 2.1 试剂和主要仪器 一.试剂 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8.2，内含 2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含 4mmol/L EDTA)100ml 与 0.2mol/L HCl44.76ml 混合，加双蒸水至 200ml，调 pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以 10mmol/LHCl 配制成 6mmol/L溶液，存放于冰箱备用; 所用试剂均为国产分析纯; 实验用水为自制双蒸水; 二、仪器: 721型分光光度计(上海第三分析仪器厂) 操作方法 2.2 方法 2.2.1 邻苯三酚自氧化速率的测定 在试管中按表1加入缓冲液和双蒸水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的邻苯三酚(对照管用10mmol/L盐酸代替)，迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长 325nm 处每 30s 测定一次吸光值 A0 2.2.2 SOD 活力的测定 SOD 活性测定法按上述表 1 操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量 SOD，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述 2.2.1 相同，所测吸光度为 方法2： 一、试剂及其配制: 1.pH8.2，100mM三羟甲基氨基甲烷一二甲胂酸钠缓冲液(内含2mM二乙基三氮基五乙酸)。以加200mM三羟甲基氨甲烷-二甲胂酸钠50ml(内含4mM二乙基三氮基五乙酸)加200mN盐酸22.38ml，然后用双蒸水稀释至100ml。2.10mN盐酸3.6mM邻苯三酚，用10mN盐酸配制，4℃保存。4.实验用水均应用玻璃双蒸水 二、仪器: 721型分光光度计(上海第三分析仪器厂) 操作方法 1.邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，25℃保温劝分钟，然后加入25℃预温的邻苯三酚(对照管用10mMHCI代替)，迅速摇匀，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度计中，每隔半分钟测一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。 2.SOD或粗醉抽提液的活性浏定: 测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。 酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。 邻苯三酚自氧化的机理极为复杂，从实验来看，邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧 化，释放出O易一，生成带色的中间产物。反应开始后溶液先变成黄棕色，几分钟后遂转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。我们测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，在这阶段，中间物的积累在滞后30~45秒后，就与时间成线性关系，一般线性时间维持在4