实验五-大蒜sod制备.doc

实验五制备大蒜SOD 实验申请 实验题目： 实验原理: 利用丙酮沉淀法，从大蒜汁中分离提取SOD 实验原料：新鲜蒜瓣约20g 实验仪器：离心机 超声波细胞破碎 分光光度计 辅助仪器：电子天平、圆底烧瓶、烧杯、玻璃棒、真空泵、分液漏斗、研钵等 实验试剂：50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)缓冲液、氯仿、乙醇、预冷丙 酮、活性测定缓冲液 参考书目： [1] 李永利,张众.邻苯三酚自氧化法测定活性 [J].中国卫生检验2000,12,10(6):673 [2] 孙永君. 大蒜中SOD 的提取研究[J].化学与生物工程.2005,(10):23～25 [3] 邹芝芳,刘佳佳.三种大蒜中提取SOD 的对比研究[J].食品科学2004,34(5) [4] 张丽,罗丽萍,谷力.大蒜SOD 的分离纯化及其低温胁迫下的酶活性[J].吉首大学学报 .2003,24(4) 实验记录 操作记录：制备大蒜SOD 操作说明及结果记录： 校正天平后，取新鲜蒜瓣 20g ↓可以数组合并进行。 组织捣碎机处理10min。 ↓合并破碎者，需要先分 开，再进行相关操作。 加入50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5) 150ml 磷酸缓冲液，搅拌均匀。 ↓ 超声破碎(5s+10s)40 times (冰水浴) ↓搅拌浸提10min 先用纱布过滤，再用漏斗过滤，得滤液 ↓60℃ 热变性20min 过滤或离心去除沉淀，得上清液，测体积V1。 ↓ 另取适量体积的(20ml)滤液，加2 倍体积的 氯仿-乙醇(3：5)，于分液漏斗中振荡5min。 ↓ 分离上层水相，加入等体积的预冷丙酮。 ↓搅拌15 分钟，使沉淀完全。 4000rpm,15min 离心，收集沉淀 ↓注意先称离心管质量 将沉淀称重，得产品，计算收率。 部分沉淀用活性测定缓冲液溶解，用于 SOD 活性检测，计算总的酶活与得率。 实验结果与分析 数据整理： 空离心管质量： 第①组 4.131g 第②组 4.056g 粗体物与容器质量： 第①组 4.265g 第②组 4.223g 产品质量： 第①组 4.265-4.131=0.134g 第②组 4.223-4.056=0.167g 冰丙酮沉淀SOD 冰丙酮加入溶液中后出现大量白色絮状沉淀，在10000rpm下高速离心出现淡黄色沉淀。 邻苯三酚自氧化抑制标准曲线制作 邻苯三酚自氧化速率测定表1： 试剂 测量管 空白管 Tris-HCl PH8.0 100mmol/L 4.5 4.5 ddH2O 2.2 2.5 PH8.7磷酸缓冲溶液 2.0 2.0 邻苯三酚3mmol/L(用10mmol/L HCl配制) 0.3 0.0 酶活力测定表2： 试剂 测量管 空白管 Tris-HCl PH8.0 100mmol/L 4.5 4.5 ddH2O 2.2 2.5 酶溶液 2.0 0.0 PH8.7磷酸缓冲溶液 0.0 2.0 邻苯三酚3mmol/L(用10mmol/L HCl配制) 0.3 0.0 吸光度测定数据： 浸提温度条件：室温 时间 吸光度 邻苯三酚自氧化 酶活抑制邻苯三酚自氧化 0.0 0.066 0.069 0.5 0.084 0.081 1.0 0.098 0.092 1.5 0.105 0.100 2.0 0.115 0.111 2.5 0.122 0.119 3.0 0.128 0.128 3.5 0.135 0.134 4.0 0.142 0.140 4.5 0.144 0.149 5.0 0.149 0.152 由于0-3s之间的吸光值与时间基本符合线性关系，所以去0-3s间数据做曲线得： 邻苯三酚自氧化标准曲线方程： R2=0.9627 酶活抑制邻苯三酚自氧化方程： R2=0.9963 邻苯三酚自氧化速率A0=0.0199 加入SOD后邻苯三酚自氧化速率A=0.0194 数据分析： 从标准曲线上可以看出加入SOD的吸光度直线斜率略小于未计入酶溶液之前，说明SOD对邻苯三酚自氧化现象有抑制作用。但从实验结果分析，抑制作用不明显，直线斜率改变不大。也反映出分离提取的SOD纯度不高，提取效率较低，分析有以下几点原因： 在浸提步骤中，前两组采用60℃水浴浸提，浸提效率较高，抑制效果较为明显；本组实验采用室温条件下浸提，浸提时间较短，浸提不够充分，提取效率较低，抑制效果不明显，与前两组形成