蛋白分子酶学 重要考点及答案.docVIP

理解酶的酸碱催化，以碳酸苷酶的催化反应中，酸和碱分别是什么？ 酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接收质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制，狭义的酸碱催化指在水溶液中通过高反应性的质子和氢氧离子进行的催化，其催化的表观速率常数仅依赖溶液的pH而不受缓冲液浓度的影响。广义的酸碱催化是指通过H+1和OH-1 以及能够提供H+1和OH-1的供体进行的催化，其催化的表观速率常数不仅依赖溶液的pH而不受缓冲液浓度的影响。在生理条件下，因H+1和OH-1的浓度甚低，故体内的酶反应以广义的酸碱催化作用较为重要。如氨基、羧基、巯基、酚羟基及咪唑基等能栽在近中性的pH的范围内，作为催化性的质子供体或受体，可提高反应速率102和105倍。影响酸碱催化反应速率的因素：酸或碱的强度及质子传递的速率。咪唑基解离常数常数约为6.0，中性条件下，即可做质子供体，又可做质子受体，且速率迅速。所以组氨酸含量虽少，却占很重要的地位。以碳酸苷酶为例，碳酸酐酶 （CA） 家族，α-CA（与人酶同源的CA)；β-CA ( 植物,细菌） Zn2+ His，Cys，Cys ；r-CA(古菌）Zn2+ His，His，His在三聚体之间的界面上。如下图：碳酸苷酶催化CO2 和H2O反应生成碳酸苷。由图中可知，实际是由H2O提供质子H+，而由CO2接收质子，故广义的碱基团为-COO-和广义的酸为H2O。酸碱催化生成碳酸苷。碳酸酐酶是一种活性中心含有Zn2+ 、能催化CO2 + H2O HCO3- + H+ 反应的金属酶。其催化作用主要是通过酶活性区域内的一系列重要氨基酸残基及与这些残基配位连接的Zn2+ 来实现的。Zn2+ 位于酶的活性区域底部，催化所必需的该并与β-链上的氨基酸残基His94 , His96 , His119 的季铵氮原子配位结合, 另外再与第四配基H2O 或OH-(取决于溶液pH: pH 7 时与H2O; 生理条件下pH 7 , 与OH- ) 相连而形成四面体结构。这些与Zn2+ 相连的直接配体, 能够通过其分子中的氢键供体(咪唑基仲胺N上的H) 与酶分子中具有氢键受体的残基相连。CAⅡ对CO2 的催化过程主要可以分为两个步骤: ( 1) 生理条件下, 与Zn2 + 相连的H2O 去质子化形成EZnOH - , 由于氢键系统等结构的存在, 使得与Zn2 + 相连的OH- ( EZnOH- ) 中的氧具有很强的亲核性, 它能亲核进攻结合于疏水袋中的底物CO2 , 首先形成EZnHCO3- , EZnHCO3。在催化过程中H+ 向溶剂中的转运主要是通过位于酶分子活性区域, 距离Zn2+ 约7的His-64，形成质子穿梭机制来实现的, 并且分子内质子向溶剂中转移的步骤也是CAⅡ催化反应中的限速步骤。 2 如何求Km，Kcat，Ki。这些常数的意义以及相互关系是什么？ Kcat：催化常数，转换数 (Turnover Number)指单位时间内每个酶分子(或活性部位) 转换底物为产物的分子数目。在正反应途径中, kcat 不可能大于任何一步的一级速度常数。在特定条件成立时，kcat 可以是简单的一级速度常数，反映限速步骤的速度。在一般情况下, 无论多么复杂的反应，kcat 是所有一级速度常数的函数。影响因素：化学反应，产物释放和构象变化等。总之，kcat 是一级速度常数，它反映酶-底物、酶-中间物以及酶-产物等复合物的性质和反应速度。 Km为米氏常数，可以看作是酶的表观解离常数。Km可以被看做所有结合酶形式的整个解离常数。Km = [E][S]/ ([ES] 。由于v/Vmax = [S]/(Km+[S]), 无论什么情况下，当v = 1/2Vmax时的底物浓度等于Km值。 kcat/Km 是二级速度常数, 反应速度vo 只与自由酶浓度 [E] 有关，而不是与结合酶浓度 [ES] 或总酶浓度Eo有关。kcat/Km 反映游离酶和自由底物的反应和性质。即使存在竞争性的非生产性结合, kcat/Km 不受影响。比较竞争底物的专一性，根据 kcat/Km 值而不是 Km 值。因为kcat/Km不受非生产性结合的影响,也不受中间产物积累的影响。酶的专一性所反映的是整个活性部位的性质，包括底物结合与催化两个方面。因此，反映酶的专一性的动力学常数是 kcat/Km 而不是 Km。因此，对一个酶促反应而言, 当 kcat/Km 值达108 s-1M-1时，kcat/Km 的限速步骤在于酶与底物结合中的分子扩散，达到了极限。 3 平衡态和稳态的相互关系？当什么时候，Ks=Km？ 4 酪氨酰氨脱tRNA合成酶的突变型中Km，Kcat，Kcat /Km值的测定可以得出什么结论？ Kcat Km Kcat /Km 野生型 7.6 0.9 4800 H