雌激素水平对大豆苷原（DAI）促成大鼠骨细胞分化作用的影响.pdfVIP

丁巧灵，等 ．雌激素水平对大豆苷原(DAI)促成大 鼠骨细胞分化作用的影响 193 为含 296／FBS的MEM 培养液。给予 DAI(美 国 CCATCTTCCA一3 ／5一GTGGTTCACACCCATCACA— Sigma公司)1、100和 10000nmol／L和等量 MEM A-3(198bp，DQ403053)。实验操作按试剂盒说 培养液 (对照组)分别作用 3和 6天，采用对硝基苯 明，产物经融解曲线单峰验证 ，获得 ct值 ，计算各测 甲酸 (p—nitropheny—phosate，PNPP)法和MTT法检 试基 因与内参基因GAPDH 比值作相对量分析 。 测细胞 ALP活性和细胞增殖率 。为观察雌激素状 统计学方法 数据采用 32±S表示。增殖和 态的影响，通过添加 1731一雌二醇 (美 国Sigma公司) ALP活性 的均数 比较采用 SPSS11．0软件进行单 至 100、1000和 10000pmol／L以调整培养液的雌 因素方差分析 ，组 间比较采用 LSD-t检验 ，差异显 激素基础水平 ，给予不 同浓度 DAI作用 6天 ，观察 著性检验水平设为双尾 0．05。基因表达的均数 比 细胞 ALP活性变化。为减少血清中雌激素样物质 较采用 StudentSt检验 ，差异显著性检验水平设为 的影响，进一步采用含 2％去激素胎牛血清 (coat— 单尾 0．05。 stripedFBS，CSFBS)(澳大利亚 Serana公司)的 MEM培养液 ，观察雌激素在基础水平对 DAI作用 结 果 的影响。 为研究低雌激素增强作用的机制，细胞分别接种 DAI促进体外培养成骨细胞的分化 体外培养 于直径 35mm的培养皿 ，汇合后更换为含2％0CSFBS 大 鼠成骨细胞于含 2 FBS的MEM 培养液生长 良 的MEM培养液 。随机分为 4组 ，每组 4皿 ，分别单 好 (图1A)，胞质呈ALP染色阳性 (图1B)。加入 1、 独或合并给予 100nmol／LDAI和 100pmol／L1731-雌 100和 10000nmol／LDAI作用 3天，细胞增殖受 二醇 (DAI、DAI-E、E组)和等量 MEM 培养液 (Ctrl 抑 ，ALP比活性较对 照组 略有增加 (P0．05，图 组)。6h后收获细胞，采用 real—timePCR法检测雌 1c、D、E)。作用 6天 ，细胞增殖受抑而 ALP活性增 激素受体 (estrogenreceptor，ER)o、【ER31和过氧化物 强明显 ，ALP比活性较对照组增加 14 ～22 (P 酶体增殖物激活受体 (peroxisomepro1iferator_actived O．001)，其 中 以 100nmol／L剂量组增 幅最大 receptor，PPAR)7的表达水平 。 (图 1F)。 细胞 ALP活性 取 96孔板培养 的细胞 ，经药 DAI的促分化作用与基础雌激素水平有关 含 物干预后 ，分别采用 PNPP法和 MTT法检测 总 2 FBS的MEM 培养液中，通过添加 1731一雌二醇调 ALP活性和细胞增殖率 ，分别 以D。／孔和 D ／孔 整雌激素基础水平后 ，观察不 同浓度 DAI对成骨细 表示 ，并以D。／D 。计算细胞 ALP比活性。 胞的作用 。结果显示 ，在 1731一雌二醇为 100和 1000 real-timePeR分析细胞mRNA水平 以TRTzol pmol／L的基础上各剂量 DAI的增殖抑制作用明显 (北京天根生化科技有限公司)一步法抽提成骨细胞 缓解(图2B)，同时其促分化作用减弱(图2C)。100 总RNA，采用 QuantiTectRev．逆转录试剂盒 (德 国 nmol／LDAI作用下细胞 ALP比活性增 幅 由未添 Qiagen公 司)逆转录合成 cDNA，采用 QuantiTect 加基础雌激素的23 降至添加 100pmol／