单细胞PCR用于HLA分型的研究.pdfVIP

40 临床检验杂志2008年第26卷第1期 Chinese Journal of Clinical Laboratory Science，2008，Vo1．26，No．1 文章编号：1001-764X(2008)01-0040-02 中图分类号：R392．11 文献标识码：A · 实验研究 · 单细胞 PCR用于HLA分型的研究 马万山 ，吴镇 ，李田 (1．山东省千佛山医院检验科，济南250014；2．山东大学第二医院检验科，济南250012；3．山东省高新 技术投资有限公司生物项目组，济南250001) 摘要：目的 探讨单细胞PCR用于妊娠前HIA诊断分型。方法 分别采用碱、蛋白酶和冻融裂解法制备单细胞DNA模板， 然后采用多重PCR分别扩增HIA．A，HLA．B基因的第2、3外显子和第2内含子区域，HLA．DrB1基因的第2外显子区域。结 果 酶裂解法可有效制备单细胞DNA模板，单细胞DNA扩增成功率95％，所设计引物可有效扩增HLA-A、B和DrB1序列，全 部操作可在6 h内完成。结论 本研究建立的巢式多重PCR技术对单细胞HLA分型具有较高的扩增效率，操作时间短，可望 应用于临床妊娠前诊断。 关键词：植入前诊断；人淋巴细胞抗原分型；单细胞PCR 胚胎种植前遗传学诊断 (preimplantation genet— PCR buffer；0．5 1％ Tween一20；0．5 1％ Triton ic diagnosis，PGD)是基于体外受精、早期胚胎活检 X一100；3．5 l ddH2O；0．05 l proteinase K)，离心后 技术和分子生物学基础之上的一种遗传病产前诊断 加20 l矿物油；45 oC孵育15 min后95 cC孵育20 方法，且不影响胚胎的进一步发育…。HLA配型可 min以灭活proteinase K并变性DNA。 为某些遗传性疾病或恶性肿瘤患儿提供HLA吻合 1．2．3 冻融裂解法 含单个淋巴细胞的薄壁管短 的同胞间脐血干细胞或骨髓移植 』。目前单细胞 暂离心后，加人10 l ddH：O，并迅速置人一80 cC冰 单基因PGD检测已较为成熟，而单细胞多基因PGD 箱内冰冻，取出融化，反复冻融2次，加上10 l矿 检测尤其是HLA配型的PGD鲜有报告。为提高单 物油，95 cC变性20 min。单淋巴细胞DNA模板制备 细胞扩增效率，增加HLA配型的可靠性和成功率， 后应立即进行PCR或储存于一80 cC冰箱。 我们以单个淋巴细胞为研究载体，对影响单细胞 1．3 HLA基因位点扩增 采用巢式PCR，第1轮 DNA模板制备的相关因素进行初步探讨。 扩增上下游引物(由上海博亚公司合成)分别对 1 材料与方法 HLA—DrB1基因的第2外显子区域和HLA—A、B基 1．1 分离单个核细胞 健康人外周血 2 ml 因的第2、3外显子和第2内含子区域进行扩增，序 EDTA—Na抗凝(EDTA终浓度1．5 mg／m1)，经淋巴细 列见表1。在制备的单淋巴细胞PCR扩增模板中加 胞分离液(上海试剂二厂)分离得到单个核淋巴细 人 10×PCR buffer 2．5 l；2．5 mmolfL dNTP 4 txl； 胞，梯度稀释于生理盐水内，于显微操作仪(Olympus Taq酶(TaKaRa Tyrobest Taq，大连宝生物公司) ON3系统)下挑取单个淋巴细胞，加人0．2 ml薄壁 0．125 U；25 mmol／L MgC12 1 l，20 mmolfL的HLA— PCR管内备用；吸取周围生理盐水1 l加人另一管 A、HLA—B位点上下游引物各 1 l，HLA—DrB1位点 中作空白对照。 上下游引物各0．1 l；灭菌水补足至25 l。PCR程 1．2 单细胞DNA模板制备方法的选择 共采用3种 序：96 oC 1 min，65 oC 1 min，72 oC 1 min进行5循 方法制备单细胞DNA模板，每种方法60个细胞样本。 环；94 o