实验十四血清甘油三酯（tg）的测定..doc

实验十二　血清甘油三酯（TG）的测定 血清甘油三酯测定方法较多，但主要包括提取、吸附、皂化、氧化，还原及显色等步骤。近年发展的酶学方法测定操作步骤虽然简单，但要许多纯酶制剂，此外还有光散射测定法，亦需要特点器材，故不易推广使用，现介绍两种常用的方法： 一、酶法测定甘油三脂 【原　理】 甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油和ATP在甘油激酶（GK）的作用下生成3－磷酸甘油和ADP，3－磷酸甘油经磷酸甘油氧化酶作用生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢。过氧化氢、4－氨基替吡啉和苯酚在过氧化物酶（POD）的微化生成红色的醌类化合物，颜色的深浅与含量成正比。反应过程如下： 1、TG　　　　 甘油＋脂肪酸 2、甘油＋ATP　　　　 3－磷酸甘油＋ADP 3、3－磷酸甘油＋O2　　　　　　　 磷酸二羟丙酮＋H2O2 4、H2O2＋4－氨基安替吡啉＋苯酚　　　 红色醌类化合物 【试　剂】 TC酶试剂盒（商品） 【操　作】 取三支试管，按下表操作： 标准管 测定管 空白管 血清（μl） — 20 — TG标准液（μl）（2mg/ml） 20 — — TG酶工作液（ml） 1.0 1.0 1.0 H2O（μl） — — 20 混匀，37℃水浴15分钟，保温结束后，以空白管调零，520nm处比色测定光密度。 【计　算】 TG（mg%）　　 ×2×0.02× 正常值：50－150mg％ 【注意事项】 1、清晨空腹血清为好。 2、干粉配成酶工作液后，在2—8℃条件下可保存7天。 【临床意义】 血清TG随进食脂肪后即见上升并出现混浊。空腹脂肪餐后2—4小时内，血清混浊度及甘油三酯含量达高峰，8小时后，基本恢复空腹水平。血清TG有随年龄而上升的趋势，体重超过标准者也往往偏高。 家庭性脂质代谢紊乱、糖尿病、肾病综合症、粮原累积病、动脉粥样硬化、酒精中毒、垂体、甲状腺功能低下者、胰腺炎等疾病TG可增高。 原发性β－脂蛋白缺乏、甲状腺机能亢进、肾上腺皮质机能不全等疾病TG均可降低。 二、乙酰丙酮法 【原　理】 血清中甘油三酯经正庚烷一异丙醇混合溶剂抽提后，用氢氧化钾溶液皂化成甘油，并进一步用过碘酸氧化成甲醛，在NH4＋的存入下，甲醛与乙酰丙酮反应生成3,5—二乙酰—1,4—二氢二甲基吡啶，后者为带荧光的黄色物质。与同样处理的标准液比色计算，即得血清中甘油三酯的含量，反应式如下： 【试　剂】 1、抽提剂：正庚烷/异丙醇＝2/3.5（v/v） 2、0.04MH2SO4 3、异丙醇（A.R） 4、皂化试剂：取6.0gKOH溶于60ml蒸馏水中，然后取异丙醇40ml混合，置棕色瓶中室温保存。 5、氧化试剂：称取65mg过碘酸钠溶于约50ml蒸馏水，然后加入7.7g无水醋酸铵溶解，再加6ml冰醋酸，并加水至100ml。贮棕色瓶内室温保存。 6、乙酰丙酮试剂：0.4ml乙酰丙酮加到100ml异丙醇中，混匀，置棕色瓶内室温保存。 7、三油酸甘油酯标准液： 贮存液（10mg/ml）：精确称取三油酸甘油酯1.000g，溶解于抽提剂中，定容至100ml，置冰箱存。 应用液（1mg/ml）：贮存液用抽提剂10倍稀释，置冰箱保存。 【操　作】 带塞试管3支，编号，按下表操作： 测定管 标准管 空白管 血清（ml） 0.2 — — 应用标准液（ml） — 0.2 — 蒸馏水（ml） — 0.2 0.2 抽提剂（ml） 2.5 2.3 2.5 0.04MH2SO4(ml) 0.5 0.5 0.5 边加边摇，加好后，剧烈振摇15分钟，静置分成二相后，准确吸取各管上层清液0.3ml，分别加至另外三支试管中。按下表操作： 异丙醇（ml） 1.0 1.0 1.0 皂化试剂（ml） 0.3 0.3 0.3 充分混匀，置65℃水浴中3分钟 氧化试剂（ml） 1.0 1.0 1.0 乙酰丙酮试剂（ml） 1.0 1.0 1.0 混匀，置65℃水浴中15分钟，取出后冷却，于420nm处，以空白管调零点，读取各管光密度。 【计　算】 甘油三酯mg=　 　　　×0.2× = ×100 【注意事项】 1、应空腹采血，否则结果偏高。 2、显色后光密度随时间延长而略增高，故应立即比色。标本多时，可置冷水浴中逐管比色，这样对结果影响不大。