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基于DNA熔解曲线技术的金银花种质鉴定 　　[摘要] 将高分辨率熔解曲线（high resolution melting curve analysis，HRM）技术应用于金银花种质鉴定中，对已知7对SSR（简单重复序列，simple sequence repeats）引物进行筛选，通过熔解曲线峰型及Tm差异，确定适合鉴别引物并考察其DNA模板浓度、退火温度及循环数的适宜范围。结合SIMCA-P软件对荧光信号进行处理分析，结果表明利用其中4对引物的熔解曲线可以区分金银花的3个主栽种质，为进一步完善金银花种质鉴定方法提供了依据。 　　[关键词] 高分辨率熔解曲线；金银花；种质鉴定 　　[Abstract] To establish a new high resolution melting analytical method for identification of Lonicera japonica germplasm，the screening of 7 pairs of SSR （simple sequence repeats） primers，determining the suitable diagnostic primers by the differences of peak pattern and Tm was conducted. Then into the DNA template concentration，annealing temperature and the suitable range of cycle number were investigated. Combined with SIMCA-P software for data processing analysis，the results show that three main germplasm honeysuckle could be divided by four sets of primers. It provides methodology for improving L. japonica germplasm identification. 　　[Key words] high resolution melting；Lonicerae Japonicae Flos；germplasm identification 　　doi：10.4268/cjcm 　　药材金银花的基原植物为忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb.，在长期的栽培过程中其形态发生了明显的变异和分化，形成了很多农家栽培品种或品系[1-2]。近年来，随着金银花价格走高，栽培面积扩大，新兴产区与传统产区间交互引种，致使出现同质异名或异质同名情况，限制了生产发展和种植效益的提高。由于不同种质金银花在植株形态、药材产量与质量等方面均表现出明显差异，因此建立合适的种质资源鉴定方法，对于金银花的种质资源评价、良种选育、规范种子种苗市场以及保障药材品质均有重大意义。利用分子生物学技术进行种质资源分类与鉴定已取得重要进展，本课题组前期通过对金银花栽培种质进行调查与分类，表明7对SSR（简单重复序列，simple sequence repeats）引物的指纹图谱可作为“分子身份证”区分全国58个金银花种质[3-4]，但该方法需要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱进行检测，操作复杂、耗时长。 　　为了建立准确、快速、可视化的主栽种质鉴定方法，本研究将高分辨率熔解曲线（high resolution melting curve analysis，HRM）技术应用于金银花种质SSR鉴定中。高分辨率熔解曲?分析是在实时荧光定量PCR基础上发展起来的一项新技术，其通过监测DNA双螺旋随温度升高时解链情况变化，具有简便、快速、高通量、对样本无污染等优点，在中药鉴定中显示出良好的应用前景 [5]。使用HRM技术检测SSR标记，与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳分型相比，不需要PCR后续处等步骤，大大降低了检测时间并提高了灵敏度和特异性[6-7]。本研究使用HRM技术检测金银花种质的7对SSR鉴定标记，通过熔解曲线峰型及Tm差异，实现了金银花3个主栽种质的可视化鉴定，为金银花种质的栽培、流通、追溯监管及仲裁提供依据。 　　1 材料 　　1.1 仪器 　　Light Cycler 480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪（Roche公司），DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京市六一仪器厂），5810R型低温冷冻离心（Eppendorf公司） ，MM 400型混合型球磨仪（Retsch公司），数显恒温水浴锅（HH-2型，国华电器有限公司），紫外凝胶成像分