BMP-2诱导MSCs修复无血运区半月板损伤实验探究.docVIP

BMP-2诱导MSCs修复无血运区半月板损伤实验探究资料与方法 实验动物：6～12个月龄新西兰大白兔36只，雌雄不限，体重2～3kg。 实验方法： ⑴自体纤维蛋白原的制备：用10ml无菌注射器自兔股动脉抽取动脉血约10ml，注入10ml无菌试管内，每个无菌试管内预先注入1ml的10%枸橼酸钠溶液并涂布整个试管壁，所得兔血经3200rpm离心10分钟后去除沉淀的血细胞，保留上清(即兔血浆)。向兔血浆中按体积比例5:1加入4℃的饱和硫酸铵溶液，立即出现乳白色的絮状沉淀。经3200rpm离心3分钟后去除上清，所得的乳白色沉淀即为兔的纤维蛋白原，-20℃保存备用。 ⑵骨髓间充质干细胞的分离及培养：无菌条件下，从自体新西兰大白兔双侧股骨转子用骨髓穿刺针穿刺，10ml无菌注射器抽出骨髓约5ml，离心后标本从上至下依次为:稀释液层、呈乳白色絮状的有核细胞层、分离液层及管底的红细胞层，小心吸取富含有核细胞的界面层，骨髓间充质干细胞即包含在该层细胞中；用MDME培养基洗涤1次加入DMEM完全培养基制成单细胞悬液，计数细胞，测定细胞活力。以5×104/ml的密度接种于75ml培养瓶中，置于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中。培养第2天首次换液，换液时将培养液中悬浮的细胞离心收集后置入原瓶内继续培养，以后隔天换液1次，倒置显微镜下逐日观察细胞形态及生长情况。 ⑶纤维蛋白胶、骨髓间充质干细胞及BMP-2混合物的制作：原代骨髓间充质干细胞培养第10天左右，倒置显微镜下呈融合状，收集原代的MSCs，用DMEM培养液制成1×106/ml的细胞悬液，并将纤维蛋白原解冻后预加温至37℃，备用。向24孔板的的每孔中滴入100μl骨髓间充质干细胞悬液，加入200μl的纤维蛋白原溶解于细胞悬液中。再先后加入预先加热至37℃的40mmol/ml氯化钙溶液60μl及50IU/ml的凝血酶溶液40μl，然后置于37℃恒温箱中数分钟至纤维蛋白胶凝块形成，最后在置入半月板缺损处时快速用微量注射器将已溶于1μl无菌蒸馏水的5mgBMP-2注入其上，即制成纤维蛋白胶、骨髓间充质干细胞及BMP-2混合物。 ⑷动物模型的制作：6～12个月龄新西兰大白兔36只，雌雄不限，体重2～3kg，随机分成A、B两组，每组18只。以质量分数25mg/ml的戊巴比妥钠对实验动物进行耳缘静脉注射麻醉(1ml/kg)。无菌条件下，取双膝髌韧带内侧弧形切口，沿髌骨内上缘至胫骨结节处切开皮肤，在髌韧带内侧切开关节囊，将髌骨向外侧脱位，屈曲膝关节，以小拉钩显露半月板前角、体部及股骨髁软骨面，用无菌手术刀片于半月板体部无血运区作一长约0.5cm，宽约0.1cm纵形全层裂伤。A组(36膝)每只对其双膝随机采取一侧于半月板损伤区注入纤维蛋白胶(FG组)，另一侧为空白对照组(NT组)，对损伤区不做任何处理；B组(36膝)对其双膝随机采取一侧于半月板损伤区注入纤维蛋白胶与骨髓间充质干细胞混合物(FM组)，另一侧于膝关节半月板损伤区注入纤维蛋白胶+骨髓间充质干细胞+骨形态发生蛋白混合物(FMB组)，所有半月板损伤区均依靠凝胶的黏附性与缺损周围组织紧密黏连，不予缝合。逐层关闭切口，1-0线缝合，所有术肢不行固定。术后每只兔子给予8万U庆大霉素，连续7天。 ⑸组织取材及检测方法：分别于术后4周、8周、12周以静脉气栓法将实验动物处死，分别取下半月板，修去多余的组织，半月板损伤区修复情况行大体观察、光镜组织学检查及电镜检查。①大体观察：观察伤口有无感染，关节有无充血、水肿及黏连；半月板损伤区的修复情况，纤维蛋白胶有无脱落，损伤区有无新生组织及其平整性、光泽度及其与周围组织的结合情况，将观察到的全部半月板愈合情况，按评定指标对其进行效果评定，并进行统计学分析。②光镜组织学检查：观察新生组织的结构组成，半月板损伤区纤维软骨的数量变化，基质分泌及胶原纤维的结构，以及FG支架的吸收情况，12周时行GAG组织化学染色，光学显微镜下观察修复组织中GAG染色的情况，以周围正常纤维软骨组织饱和着色定为100%，组织不着色定为0%，色度高低对应GAG含量，计算机HPIAS-1000高清晰度彩色病理图象分析系统进行分析，统计学处理。组织取材后，修剪组织块，制成切片，HE染色及甲苯胺蓝染色。 结 果 所有实验动物术后无感染，无死亡，术后1周内略有跛行，1周后恢复正常。 大体观察：所有动物关节无红肿，关节腔内有少许谈黄色关节液，清亮透明。关节囊无挛缩，无黏连，滑膜无充血，无水肿。①空白对照组(NT组)：术后4周，半月板纵行全层裂清晰可见，缺损处无填充物，表面凹凸不平，边缘清晰。术后8周，半月板缺损区有薄层膜性组织覆盖，边缘清楚，色泽灰暗。术后12周，半月板缺损区较前略有缩小，边缘不整齐，色