双向电泳一质谱法探索实验性重症肌无力大鼠疾病相关蛋白.doc

双向电泳一质谱法探索实验性重症肌无力大鼠疾病相关蛋白摘要：目的：分离和鉴定实验性自身免疫性重症肌无力大鼠血清差异表达蛋白，寻找并比较疾病相关蛋白，以进一步阐明重症肌无办的发病机制。方法：采用二维蛋白电泳技术分离正常组和模型组大鼠血清差异表达蛋白，凝胶经银染显色后，Bio-Rad凝胶扫描仪扫描，Imagomaster图像软件分析，差异蛋白点用基质辅助激光解析电离一两级飞行时间串联质谱法进行鉴定。结果：通过双向电泳，建立血清蛋白质双向电泳图谱，重症肌无力组血清双向电泳图谱可见678个蛋白点。而正常对照组可见702个蛋白点。选取9个具有明显差异的蛋白点进行质谱鉴定，共鉴定出5种蛋白质。结论：正常组和模型组大鼠闻存在一定的差异表达蛋白。该类蛋白为一些与机体免疫应答、信息调控相关的蛋白质。 关键词：重症肌无力；蛋白质组学；双向电泳；血清；差异蛋白 中图分类号：R-33 文献标识码：A 　文章编号：1673-7717(2007)12-2486-04 重症肌无力(Myasthenia gravis，MG)是累及神经肌肉接头(NMJ)处突触后膜上乙酰胆碱受体(Acetylcholine Re-ceptor，AchR)，主要由乙酰胆碱受体抗体(AchRab)介导，细胞免疫依赖，补体参与的自身免疫性疾病。目前临床上对于MG的治疗多采用西药对症处理，如胆碱酯酶抑制剂、激素、血浆交换等等，尚缺乏有效根治手段。本研究以实验性自身免疫性重症肌无力大鼠为模型，采用双向电泳一质谱(Two dimensional gd dectrophorcsiS-mass spectrometry，2DE-MS)技术来分离和鉴定生理状态与病理状态的差异表达蛋白，为进一步研究MG发病机制及有效的中医药治疗手段提供实验依据。 1.材料与方法 1.1材料 1.1.1EAMG模型的制备与标本采集　雄性Lewis大鼠96只，SPF级，体重(170±10)g，由中科院实验动物中心提供。分为造模组、正常组、佐剂组。其中造模组80只，正常组和佐剂组各8只。造模组每只给予80μg乙酰胆碱受体(AchB)分两次免疫，造模按Lennon氏方法进行，正常组予等体积生理盐水处理。佐剂组予等体积弗氏完全佐剂处理。4周后造模组大鼠knnon氏2分7只。Lennon氏1.5分4只，Lennon氏1分35只，knnon氏O分34只，成模率为57.5％。随机抽取Lennon氏评分1分大鼠8只作为模-型组。取血清，-70℃冰箱冷冻保存备用。 1.1.2主要试剂　固相pH梯度干胶条IPG strip(Artier-sham公司，非线性pH3～10，13cm)。CHAPS，二硫苏糖醇(DTT)，尿素，硫脲，碘乙酰胺(IAA)，丙烯酰胺(acry]am-ide)、甲双丙烯酰胺(N，N-methylenebi sacrylamide)，四甲基乙二胺(TEMED)，过硫酸铵，三羟甲基氨基甲烷(tris)、甘氨酸(glycine)、十二烷基磺酸钠(SDS)均购自Bio-Bad公司。琼脂糖购自华美生物公司。其他试剂均使用国产分析纯试剂。所有溶液均用MilliQ水配制。 1.1.3主要仪器　高速冷冻离心机(eppendorf，德国)、Ettanu　IPGphor(Amershara Biosciences)，分光光度仪(P-2000，Hitachi公司)，电泳仪(SE-600全套电泳设备，Amer-sham公司)，纯水装置(Millpore公司)，光密度扫描仪(GS-710，Bio-Rad公司)，冷却水循环系统(Cole-Panner公司)，Bruker-DahonicsAutoFlexTOF-TOF LIFTMass Spec-trometer(美国Bruker-Daltonics公司)，LCQ Deea XP plus(ermo Finnigan，美国)。 1.2方法 1.2.1血清总蛋白质的提取与定量　血清-70％反复冻融4次，用特种试剂去除Igc等高丰度蛋白。采用Agilent5K超滤管进行浓缩除盐，冻干回收样品，-70保存备用。用裂解液(9M Urea,4％CHAPS，65raM DTT，cocktail酶抑制剂)进行复溶，并采用Bradford法进行蛋白质定量。 1.2.2等电聚焦将-2.0℃保存的IPG胶条，于室温下平衡10min，以70μg上样量于每份样品中加入上样缓冲液(8M Urea，2％CHAPS，18mM DTr，0.5％IPG Buffer，Bromo-phenol blue trace)，总体积250μL，沿IPG聚焦盘中槽边缘自左向右线性加入，胶面向下轻放人泡胀槽中，加入矿物油覆盖。程序设置如下：重泡涨12h；500V-1h；