复合骨髓间充质干细胞组织工程皮肤修复烧伤创面实验探究.docVIP

复合骨髓间充质干细胞组织工程皮肤修复烧伤创面实验探究[摘要]目的：探讨用复合骨髓间充质干细胞(MSCs)的组织工程皮肤修复烧伤创面的可行性。方法：利用自行研制的烫伤仪制备烫伤创面，以MSCs为种子细胞构建组织工程皮肤修复烫伤创面，观察愈合时间和收缩率等。结果：移植2周后实验组创面基本愈合，表皮角质化，真皮层毛细血管增生，6周后创面收缩到原始面积的61％。结论：含有MSCs的组织工程皮肤移植后促进了烧伤创面的愈合，获得了较理想的愈合效果，为临床治疗提供了新的思路。 [关键词]骨髓间充质干细胞；创伤愈合；组织工程；动物模型；烧伤 [中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-64 55(2007)04-0437-03 皮肤烧伤是临床常见病症之一，大面积烧伤时仅靠创面自身难以实现皮肤的再生，需要足够的皮肤替代物进行修复。随着组织工程(tissueengineering，TE)技术研究的进一步深入，TE皮肤在体外得以成功构建并初步应用于临床，标志着皮肤缺损治疗的重大突破，具有广泛的应用前景。近年来，骨髓来源的骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells，MSCs)因具有来源广泛、取材方便、增殖快、分离培养容易等优点，已成为组织工程研究中常用的种子细胞。本研究将MNCs体外培养扩增，以胶原凝胶为支架材料构建组织工程皮肤，并用于皮肤烧伤缺损的治疗。 1　材料和方法 1．1　骨髓间充质干细胞的分离培养：无菌条件下从猪髂骨处抽取骨髓，采用Percoll(SIGMA)分离法，经密度梯度离心收集界面层的单个核细胞，PBS洗两次，离心收集细胞，重悬于体积分数为100ml/L胎牛血清的DMEM/F12培养液进行培养，隔日换液，弃去未贴壁的细胞，待贴壁细胞继续培养达80％-90％融合时，用胰蛋白酶消化，传代培养。 1．2 构建含有MSCs组织工程皮肤：取用3-5代状态良好的骨髓问充质干细胞，以1.8×106/ml的密度与提取自小牛皮的Ⅰ型胶原混合，37℃孵育30rain凝固后，加入培养液培养2天，隔天换液；在其表面以1×107/ml密度接种角朊细胞继续培养2天，将复合了细胞的胶原移至气液面进行器官培养，培养1周即获得组织工程皮肤。 1．3 烫伤模型制备：自行研制烫伤仪，通过控制系统可以调节金属烫头的温度，计时器可以控制时间，根据调整烫头和皮肤接触的时间和温度，可以制备出由浅至深的皮肤烫伤模型。术前12h禁饮食，猪麻醉后背部剃毛、清洗固定在实验台上。根据以有经验，模拟深Ⅱ度烧伤模型，调节烫伤仪至：温度100℃，时间20s。选直径50mm的烫头，当达到设定温度时，放置在猪背部皮肤20s以获得深达真皮深层的烧伤模型。实验动物3只，共制备18个烧伤创面。 1．4 动物移植实验：按实验设计随机分为3组：MSCs复合胶原移植组、单纯胶原移植组和空白对照组，每组6个创面。在创面分别植入复合MSCs的组织工程皮肤、单纯胶原。油纱布覆盖，打包缝合所有创面，空白对照组不移植任何细胞和胶原，其他处理与实验组相同。术后1周首次打开创面，常规换药，连续观察6周并进行组织学检查。 1．5 术后观察与分析：术后密切观察创面情况，定期取创面皮肤标本做病理学检察，观察愈合时间，测量各组创面面积计算创面收缩率。公式：创面收缩率=(A0-Ax)/A0×100％，A0是原始创面面积，Ax是术后第X天的面积。 2　结果 2．1　骨髓问充质干细胞：原代细胞接种后为圆形，首次换液后显微镜下可见稀疏分布的单个细胞贴壁生长，细胞为纺锤形、类圆形，7天后生长速度加快，呈典型的成纤维细胞外观，约10天汇合成片即可传代。 2．2　组织工程皮肤：光镜下可见体外培养的组织工程皮肤，与正常的皮肤相似，具有双层结构，其中表皮层较薄，真皮层较厚，表皮层和真皮层之间有基底膜，但组织工程皮肤中缺少毛囊和汗腺。 2．3　烫伤模型：在动物皮肤表面形成直径50mm的圆形烫伤面，呈灰白色，边缘是红色的充血带。组织学检查显示：表皮层破坏缺失，真皮层大部分凝固性坏死。 2．4　术后大体与组织学观察：所有实验动物到实验结束均存活，饮食、排便正常，没有术后感染、化脓、体液渗出等不良反应。在移植后1周，MSCs复合的组织工程皮肤与自体皮肤较好的融合，移植物颜色与自体皮肤颜色接近，随着时间延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，上皮角化不明显；移植后2周，创面基本愈合，移植物颜色与自体皮肤颜色非常接近，瘢痕很小，上皮增厚，角化明显，真皮层细胞生长良好，毛细血管大量增生。单纯胶原组和空白对照组未完全愈合，移植区瘢痕形成，颜色较深。各组创面的愈合时间分别为(15.2±1.6)、(18.3±2.4)和(22.4±3.9)天，差异