EGFR反义寡核苷酸对人视网膜神经胶质细胞迁移的影响.docVIP

　　EGFR反义寡核苷酸对人视网膜神经胶质细胞迁移的影响 【关键词】 视网膜神经胶质细胞;表皮生长因子受体;反义寡核苷酸;脂质体;细胞迁移 　　AbstractAIM: To observe the effect of antisense oligonucleotide(ASODN) hybridized epidermal groigration of human retinal glial(RG) cells.METHODS: Human RG cells odel in all area of a confluent monolayer of RPE cells igration easured by the number of cells that had entered the denuded area.RESULTS: The cell migration issense oligonucleotides shoigration of RG cells. 　　KEYEM/F12(Gibco公司)的混合培养液瓶中，内含100mL /L的胎牛血清(Gibco公司)，100×103U/L青、链霉素(Gibco公司)，置于950mL /L O2，50mL /L CO2，37℃培养箱内培养。于24h和48h用吸管吹打，可使视细胞、节细胞和红细胞悬浮，经换液去除得到单一的贴壁细胞。用2.5g/L胰蛋白酶(Gibco公司)消化传代，实验用第3代细胞。 　　1.2寡核苷酸的合成 EGFR ASODN的合成采用针对人EGFR基因cDNA的上游部位(包含起始密码子)的21个碱基互补序列。序列如下:5′GGC CGT CCC GGA GGG TCGCAT3′。另设与人EGFR基因cDNA无互补性的一段ODN作为毒性对照，序列如下:5′GGC CTC GGA TCC TGCTTT GCA3′。OND两端各3个碱基硫代磷酸化修饰(上海生工生物工程公司在DNA自动合成仪上合成)。22μm微孔滤膜过滤除菌，60mmol/L贮存液20℃贮存备用，使用前冰上融解。 　　1.3寡核苷酸的准备 用脂质体(Lipofectin， Gibco公司)作为载体，在2个无菌EP管中分别将2μg ASODN和10μL Lipofectin稀释于100μL不含血清及青、链霉素的DEMEM/F12中，室温下放置45min，轻轻混匀上述溶液，室温下孵育15min。然后在LipofectinASODN复合液EP管中加0.8mL无血清及抗生素的DEMEM/F12，轻轻混匀后立即用于转染。 　　1.4寡核苷酸处理细胞 以100×103个/L细胞接种于6孔板上,每孔1mL。37℃，50mL/L CO2条件下培养至细胞50%汇合(约需4～6h)。在2个无菌EP管中准备下述溶液:(1)溶液A:每次转染,将2μg ASODN稀释于100μL不含血清及青、链霉素的DEMEM/F12中;(2)溶液B:每次转染,将10μL Lipofectin稀释于100μL不含血清及青、链霉素DEMEM/F12中。将A，B液室温下放置45min，轻轻混匀上述溶液，室温下孵育15min。将6孔板中的细胞用2mL不含血清及抗生素的DEMEM/F12洗2次,然后在LipofectinASODN复合液EP管中加0.8mL无血清及抗生素的DEMEM/F12,轻轻混匀后将复合物铺于细胞上。37℃，50mL /L CO2条件下培养。 　　1.5细胞迁移实验和分组 分组为对照组、错义寡核苷酸组和反义寡核苷酸组。对照组加等体积含100mL/L胎牛血清的DEMEM/F12，错义寡核苷酸组和反义寡核苷酸组分别加入错义和反义ODN复合液处理细胞。细胞迁移试验参照 文献 [1]的方法。培养瓶底部涂鼠尾胶原,培养箱中晾干。接种培养细胞,待细胞生长融合后,如上法用寡核苷酸处理细胞，6h后用细玻璃棒紧贴培养瓶底壁,在细胞层中划线，换液2次去除漂浮的细胞，然后加入含100mL/L胎牛血清的DEMEM/F12(Gibco)，此时计为0点。在相差显微镜下，可见一条无细胞的裸露区。实验组与对照组同置入培养箱中继续培养，观察24 h裸露区两边细胞移行情况，用目镜网格器对移行至裸露区的细胞计数,实验重复3次。细胞迁移的抑制率=[(对照组实验组)/对照组]×100%。 　　1.6酶联免疫吸附法检测RPE细胞的EGFR蛋白表达 使用EGFR ELISA KIT试剂盒(ONCOGENE),实验步骤按说明书进行。 　　统计学分析：全部数据输入 计算 机，以SPSS 10.5 for L)分别为：256.17，235.29和107.37,ASODNS对RG细胞EGFR表达有抑制作用，差异有显著性意义，P=0.003，抑制率为58