GlcNAc糖基转移酶表达下调对tau蛋白磷酸化的影响.docVIP

　　GlcNAc糖基转移酶表达下调对tau蛋白磷酸化的影响 【关键词】 阿尔茨海默尔病 tau蛋白 OGlcNAc糖基转移酶 RNA干扰 ［Abstract］ Objective: To investigate the inhibitory effect of small interference RNA(siRNA)targeting OGT gene on the alteration of tau phosphorylation and glycosylation level in human being. Methods： The siRNANC and the siRNA targeting OGT gene ically synthesized and transfected into HEK293T cells via lipofectamine2000.Realtime PCR ployed to evaluate the efficacy of RNA interference. The level of tau phosphorylation and glycosylation RNA expression to 78.1% odification of phosphorylation and glycosylation of tau protein indicated the apparent negative correlation, etabolism in Alzheimer′s disease ［Key er′s disease; tau; OGT; RNA interfering 阿尔茨海默尔病（Alzheimer′s disease, AD）的病理特征包括大脑局部尤其是海马和皮层神经元退行性病变，细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)和细胞外老年斑（senile plaque ,SP）沉积。其中NFT的数量和患者的痴呆程度呈明显的正相关，被认为是AD患者神经原退化的病理基础［1,2］。NFT的主要成分是由异常过度磷酸化tau蛋白聚集而形成的双螺旋丝（paired helical filaments，PHFs）。过度磷酸化的tau蛋白除失去了其刺激和促进微管组装的功能外，还变成了毒性分子，可猎获正常的微管相关蛋白，使得微管崩解，神经细胞退化，最终导致AD患者的认知功能受到严重的损害。 蛋白质的修饰方式主要有磷酸化、糖基化、泛素化、经典糖基化、硝基化和OGlcNAc糖基化。其中蛋白质OGlcNAc 糖基化是发生在细胞质与细胞核内的一种广泛动态的蛋白质翻译后修饰现象。这种糖基化是单个N乙酰氨基葡萄糖(Nacetylglucosamine,GlcNAc)通过O糖苷键连接到丝氨酸或苏氨酸(Ser/Thr)羟基上的。 在AD患者脑中，tau蛋白OGlcNAc糖基化水平明显低于正常的老年人［3］。蛋白质的OGlcNAc糖基化程度是OGlcNAc糖基转移酶(OGT)和OGlcNAc糖苷酶（OGlcNAcase，OGA）共同作用的结果，OGT的作用是催化GlcNAc连接到肽链的丝氨酸或苏氨酸羟基上，UDPGlcNAc是它的供体底物，而OGA的作用是将GlcNAc从蛋白质的羟基上去除。用OGlcNAc糖苷酶抑制剂处理体外培养的大鼠脑片和神经细胞，以增加OGlcNAc糖基化的水平，则明显抑制tau蛋白多个位点的磷酸化，提示tau的OGlcNAc糖基化与磷酸化呈明显的负相关。本实验拟通过RNA干扰的方法来降低HEK293T细胞内OGT基因的表达水平，检测tau蛋白多个位点磷酸化与糖基化的变化，从而证明以上的推测，为进一步探讨AD的发病机制提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 细胞、培养基与质粒 HEK293T细胞株为本实验室保存。0.25% TrypsinEDTA，小牛血清，DMEM培养基，OptiMEMⅠ均为Invitrogen公司产品。pCI/tau441由日本物理化学研究所Takashima 教授惠赠。pTG19T载体购自上海捷瑞生物工程有限公司。 1.1.2 siRNA、引物及抗体 siRNA为上海吉玛制药技术有限公司合成。阴性对照（siRNANC）及5′端标记了荧光素FAM的阴性对照（siRNANCFAM）购自上海吉玛制药技术有限公司。人OGT引物与内参引物GAPDH由上海生物工程有限公司合成。抗体：抗tau［pS396］为美国Biosource Internatinal公司产品，RL2(Affinity Bioreagents, Golden, CO)用作OGlcNAc 糖