淫羊藿醇提物抑制肺癌生长及调节免疫作用研究.docVIP

淫羊藿醇提物抑制肺癌生长及调节免疫作用研究 　　[摘要]该实验采用C57BL，6小鼠Lewis肺癌模型，观察淫羊藿醇提物（HE）对C57BL/6小鼠Lewis肺癌生长的影响，研究其抗肺癌效果及免疫调节能力：同时通过ELIsA法检测血清中TNF-α，IL-10，IL-17，IL-2水平：并采用免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测肺癌组织中Ki67和P53蛋白的表达。结果表明淫羊藿醇提物对c57BL/6小鼠Lewis肺癌的肿瘤生长具有一定的抑制作用，且能够降低血清中TNF-α，IL-10和IL-17的水平，提高IL-2的水平，并且能使得Ki67的表达显著降低，P53的表达显著增强。淫羊藿醇提物对肺癌具有明显的抑制作用，并且具有一定的提高免疫调节能力的作用，揭示了淫羊藿醇提物的抗肺癌作用可能与其提高免疫调节能力有关，从而为淫羊藿醇提物抗肺癌作用的进一步研究提供了基础。 　　[关键词]淫羊藿；肺癌；抑制肿瘤生长；免疫调节 　　肿瘤是全球死亡率最高的疾病之一，据2015年癌症报告最新统计，肺癌约占全球各种肿瘤新发病例的18%，已成为威胁人类健康的一大杀手。肺癌因其恶性程度高易发生转移等特点，使肺癌的死亡率在各种恶性肿瘤中居首位。虽然手术化疗以及放疗技术的发展使肺癌治疗有了很大的提高，但这类技术往往伴随着严重的副作用，给患者的身心带来严重伤害，而大量临床研究证实中医药在抗肺癌方面的有效性，可改善临床症状，提高生活质量，延长患者的带瘤生存期 　　因此，研究能够治疗肺癌的中药具有重要的临床意义，以使肺癌的治疗取得令人满意的效果 　　中医药的抗肿瘤作用已得到广泛的肯定，其主要机制有抑制合成抑制新生血管形成促进细胞凋亡免疫调节等。 　　淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevi-COITtU Maxim、箭叶淫羊藿E.Sagittatum Maxim、柔毛淫羊藿E.pubescens Maxim.或朝鲜淫羊藿E.ko-reanum Nakai的干燥叶，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用。淫羊藿历来都是我国传统中药中的一味补益药材，在历代医学书籍中都有记载。它除了具有坚筋骨、补肾阳等药用价值，还具有心血管保护、促进骨质形成、调节机体的免疫能力、抑制癌症等重要功效。目前对于淫羊藿的抑癌作用机制研究比较少，且主要集中在乳腺癌方面，且其抗癌的作用机制尚不明了。在前期实验中发现淫羊藿具有一定的抗肺癌效果，所以本实验通过小鼠Lewis肺癌模型，来研究淫羊藿的抗肺癌活性。 　　1材料 　　LABCONCO ClassⅡ生物安全柜（美国Labcon-co公司）；HERA Cell 150 CO2培养箱（美国热电集团）；COIC XDS-1B相差倒置显微镜（重庆光电仪器总公司）；Anke TDL40B离心机（上海安亭科学仪器厂）；便携式电子天平-PL1502-S（上海METTLERTLEDO仪器有限公司）；T06001天平（天津天马恒基仪器有限公司）；ZXC型紫外消毒车（江苏巨光光电科技有限公司）。 　　淫羊藿购于安徽滕王药业，批经中国医学科学院药用植物研究所郭宝林教授鉴定为朝鲜淫羊藿。 　　C57BL/6小鼠60只，雌性，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号SCXK（沪）2015-0002。实验动物饲养于江苏省中医药研究院SPF级实验动物中心，每笼7只，饲料与饮水保持充足。室温（25±1）℃，湿度（65±5）%，每天光照12 h，黑暗12 h。小鼠Lewis肺癌瘤株购于中国医学科学院肿瘤研究所。 　　顺铂（DDP，南京制药有限公司，规格20 mL/瓶，质量浓度13 g?L-1，批；氯化钠注射剂（南京小营药业有限公司，规格100 mL/瓶，批号12012120808）；TNF-α，IL-10，IL-17，IL-2 ELISA试剂盒（联科生物科技有限公司，批号分别为201504，201503，201501，201504）。 　　2方法 　　2.1淫羊藿提取物的制备 称取1000 g淫羊藿，加入50%乙醇10 L煮沸1 h，一共2次，4层纱布过滤后，回收乙醇。5 000 r?min-1离心15 min，取上清，高压蒸气灭菌后，于4℃冰箱中贮存备用。 　　2.2 Lewis癌瘤细胞悬液的制备Lewis肺癌细胞培养至对数生长期用0.25%胰酶消化，于37℃，5%CO培养箱中消化2 min，待细胞呈流沙样流下时，迅速加入完全培养基终止消化，吹打细胞转移至离心管中（2000r?min-1离心2 min），收集底部细胞。用灭菌PBS将细胞制备成细胞悬液，显微镜下计数，调节细胞密度至1×107个/mL。接种于4只小鼠右腋下，取接种Lewis肺癌细胞5 d的小鼠，处死并于75%乙醇中浸泡2 min无