菟仙海蚣胶囊对腺嘌呤致大鼠睾丸生精细胞凋亡及Bcl-2、P53表达影响.docVIP

菟仙海蚣胶囊对腺嘌呤致大鼠睾丸生精细胞凋亡及Bcl-2、P53表达影响【摘要】 目的 探讨菟仙海蚣胶囊对生精细胞损伤大鼠睾丸生精细胞凋亡及Bcl-2、P53表达的影响。方法 建立腺嘌呤诱导致生精细胞损伤大鼠动物模型，用流式细胞仪检测菟仙海蚣胶囊对该模型大鼠生精细胞的凋亡率及Bcl-2、P53蛋白表达，同时检测大鼠睾丸、附睾指数及精子数量、精子活率。结果 菟仙海蚣胶囊可明显抑制大鼠睾丸生精细胞凋亡，升高睾丸组织细胞Bcl-2的表达，降低P53的表达，提高附睾指数，增加精子数量和精子活率。结论 菟仙海蚣胶囊治疗少精、弱精症的作用机理可能与抑制生精细胞凋亡、上调睾丸组织细胞Bcl-2的表达和下调野生型P53表达，并作用于附睾，提高附睾指数，促进精子发育成熟，增强其活力有关。 【关键词】 菟仙海蚣胶囊；细胞凋亡；Bcl-2、P53；睾丸、附睾 新药菟仙海蚣胶囊，源于我们治疗少精、弱精男性不育症的验方，由菟丝子等五味药物组成，经现代制药工艺加工而成，临床应用多年，疗效显著［1］，前期研究表明菟仙海蚣胶囊对生精细胞损伤大鼠睾丸组织形态学有显著的保护作用，其机理与降低睾丸组织中NOS活性和NO含量有关［2］。本研究观察了菟仙海蚣胶囊对腺嘌呤致大鼠睾丸生精细胞凋亡、Bcl-2、P53基因表达及睾丸、附睾指数和精子数量、精子活率的影响，以期进一步揭示其作用机理，为临床应用提供科学依据。1 材 料 1.1 实验动物 SD大鼠，SPF级，雄性，体重280-320g，由甘肃中医学院科研实验中心提供，动物实验设施使用证SYXK(甘)2004-0006，实验动物质量合格证号SCXK(甘)2004-0006；动物分笼饲养，食固体SPF级饲料，由北京市科奥协力饲料有限公司提供，合格证号：京动许字(2000)第015号。食水自由，室温20-25℃，相对湿度45%-52%。 1.2 实验药物 菟仙海蚣胶囊：处方由菟丝子、仙灵脾等五味药物按一定的比例组成。由兰州中药现代化工程技术中心及甘肃中医学院科研实验中心监制，规格0.35g/粒（3.21g生药/g胶囊），实验室时用生理盐水配置成相应浓度的溶液。 五子衍宗丸：北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，国药准字批号2009324。 1.3 试剂及仪器 羧甲基纤维素钠（河北省文安县盛源纤维素厂，批；腺嘌呤（洛阳德胜化工有限公司，批；Bcl-2和P53流式细胞免疫荧光检测试剂盒（Santa Cruz公司产品，由上海坤肯生物化工有限公司代理购进）；戊巴比妥钠（中国医药集团上海化学试剂公司，批号。碘化丙啶（PI）试剂盒、RNAse消化酶均由Sigma公司提供。流式细胞仪（XL，BECKMAN，U.S.A）；放射免疫γ计数器（CG-911，科大创新股份有限公司中佳分公司）；显微镜（BH-2，日本OLYMPUS）；低速冷冻离心机(KDC-2044，科大创新股份有限公司中佳分公司)。2 方 法 2.1 动物分组及给药 参考文献方法［3］，3个月龄SD雄性大鼠，280-320g，72只，自由进食饮水，适应3-4d后，将其随机分为6组，即空白对照组、模型组、阳性对照组（五子衍宗丸）组、菟仙海蚣胶囊组（小剂量组、中剂量组、大剂量组），每组12只。菟仙海蚣胶囊剂量按50kg成人常规剂量折算后作为中剂量组(2.7g生药/kg体重)，高剂量组为中剂量组放大一倍(5.4g生药/kg体重)，小剂量组为中剂量组缩小一倍(1.35g生药/kg体重)，阳性对照组按1.2g/kg灌胃。空白组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠1mL/100g，模型组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠0.5mL/100g，各给药组按1mL/100g灌胃，40分钟后各给药组和模型组灌胃5%的腺嘌嘌呤混悬溶液0.5ml/100g（腺嘌呤溶液用0.5%羧甲基纤维素钠配制，加热情况下配制的混悬液浓度为5%）。各组均每天灌胃1次，连续40ｄ。 2.2 各组大鼠睾丸、附睾指数及精子数量、精子活率的变化 各组大鼠于末次给药1h后称重，用3%的戊巴比妥钠45mg/kg麻醉，剖腹取两侧睾丸和附睾组织，称重，计算睾丸和附睾指数；取一侧附睾按照文献［4］进行精子活率、精子计数观察。 2.3 各组大鼠睾丸组织生精细胞凋亡率的检测 取一侧睾丸组织，PBS液冲洗干净，将组织煎碎，制成单细胞悬液，200目过滤网过滤。取单细胞悬液200μl，逐滴加入的70%乙醇（预冷）500μl固定，离心去除固定液，加PBS适量重悬5min，1500r∕min离心5min，弃去PBS液，加入RNAse消化酶，37℃消化20min，200目过滤网过滤，加入PI染液1000μl混合，于4℃避光保存30min，流式细胞仪检测。