针刺对实验性快速性心律失常大鼠延髓Gi-mRNA表达影响.docVIP

针刺对实验性快速性心律失常大鼠延髓Gi-mRNA表达影响摘要：目的：探讨针刺内关穴调节快速性心律失常的效应机理。方法：电针乌头碱所致的快速性心律失常模型大鼠双侧“内关”穴，观察针刺前后心律(率)变化；用半定量逆转录聚合酶链反应(RT－PCR)方法测定延髓中抑制性G蛋白(Gi)mRNA的相对含量。结果：针刺治疗组与模型组相比有显著变化(P＜0.05)。结论：快速性心律失常可能和延髓中G蛋白基因表达障碍有关；G蛋白在针刺内关穴对心律失常的调节中有重要作用。 关键词：针刺；内关；心律失常；延髓；抑制性C蛋白；RT－PCR 中图分类号：R－33　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2007)09－1828－03 心律失常是临床常见病证，发病机制复杂。临床和实验资料表明针刺“内关”穴对其疗效确切。G蛋白是生物信息转导过程关键的中介体，可以耦联多种受体和效应器，引起一系列细胞“瀑布”效应。笔者在以往实验中发现，针刺“内关”穴对快速性及缓慢性心律失常大鼠心肌组织中c蛋白基因表达均有调节作用。本实验通过对针刺“内关”穴调节心血管神经中枢一延髓的Gi(Gi2、Gi3)－mRNA表达的观察，探讨快速性心律失常可能和延髓中G蛋白基因表达障碍有关，为临床针灸治疗心律失常提供理论依据。 1 材料与方法 1．1　实验动物与分组　健康成年Wistar大鼠40只，由沈阳药科大学实验动物中心提供(Ⅰ级，批号：0001315)，体重(200±50)g。在本校实验动物中心饲养1周，以适应环境。 随机分为4组，每组10只。即正常组(A)；乌头碱造模组(B)(乌头碱造模不针刺)；乌头碱“内关”穴组(C)(乌头碱造模加针刺“内关”穴)；乌头碱“非经非穴”组(D)(乌头碱造模加针刺“非经非穴”)。 1．2　试剂与仪器　乌头碱(批号：110720－200410，购于中国药品生物制品检定所)。组织总RNA试剂盒、RT－PCR试剂盒、Gi2－mRNA和Gi3－mRNA引物、甘油醛－3－磷酸脱氢酶(GAPDH)引物(均由大连宝生物工程有限公司合成提供)；蛋白核酸分析仪(DU－600)；PCR仪(PE9600)；电泳仪(EPS－300)；凝胶成像分析系统(GIS120D)；电针仪(6805－A)等。 1．3　动物模型的制备　20％氨基甲酸乙酯(5mL/kg)腹腔注射麻醉，于舌下静脉注射0.002％的乌头碱(1mL/kg)。以心电图出现室性早搏二联律、室性心动过速等心律失常波形为造模成功标志。 1．4　电针方法及取材　根据《实验针灸学》大鼠针灸穴位取“内关”穴，非经非穴点取大鼠肩三角肌隆起处。用0.5寸毫针(中0.25mm)直刺2－3mm，加电针(疏密波，频率2－20Hz，强度2－3mA；或以大鼠前肢微颤为宜)，行针10min，记录心电图，然后立即从腹主动脉抽血3－5mL(减少体循环血量，防止脑组织中血液过多影响实验结果)，迅速开颅，依据《实验动物解剖图谱》取出延髓，置于0℃冰盐水中，剪取含延髓腹外侧区(VLM)(参考猫VLM范围：从延髓外侧网状核尾端向头端延伸至上橄榄核水平；其背侧分界在尾端为延髓中央腹侧亚核的腹面，头端为巨细胞核、小细胞核及三叉脊束核头部的腹面，腹侧缘为延髓的腹侧表面；内、外侧分界分别为中缝核群的外侧和脊髓小脑束的内侧)在内的50mg标本放入经DEPC(焦碳酸二乙酯)水处理过的EP管中，－70℃冷冻备用。取材时间均在尚未恢复正常心律时。 1．5　心率测定方法　大鼠麻醉后，仰卧固定于自制鼠台上，用MS2000多媒体化生物信号记录分析系统，按人体标准导联的方法连接，将针状电极插入四肢末端及剑突皮下，分别记录A组、B组给药后和C、D两组针刺后心电图，取连续10个心电周期计算平均值做为实验大鼠的心率。 1．6　逆转录－聚合酶链反应组织总RNA提取：取组织标本，按试剂盒说明书用Trizol提取总RNA，用蛋白核酸分析仪分析其纯度OD260/280，各样本均在1.9－2.0之间。逆转录：取lugRNA按逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成eDNA，经30次循环后将产物保存在－70℃冰箱中备用。PCR扩增反应：PCR反应体系：逆转录产物20μL，上下游引物各1μL，MgSO 46μL，5×Buffer 16μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，dH2O 55.5μL，总反应体系100μL。按照以下步骤进行扩增：94℃30s，56℃30s，72℃1min，循环35次，最后72℃延伸5min。选择GAPDH(528bp)作为内参与上述反应体系相同。产物分析：取12.5μLPCR产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳1h，EB染色，紫外透射仪观察，应用凝胶图象处理系统扫描摄像各条带的光密度，以GAPDH产物的光密度值作为内参