针药结合对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜Th细胞亚群影响.docVIP

针药结合对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜Th细胞亚群影响摘 要：目的：探讨针药结合对溃疡性结肠炎(UC)结肠黏膜Th细胞亚群的调节机制。方法：在成功建立大鼠溃疡性结肠炎模型的基础上，采用针刺“足三里”穴结合西药柳氮磺胺吡啶(SASP)治疗，并与单纯电针、西药、模型及正常组进行对照，免疫组化法观察UC大鼠结肠黏膜Th1/Th2型细胞因子IFN-γ、IL-12与IL-4、IL-10免疫阳性细胞的表达。结果：模型组大鼠结肠黏膜Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12免疫阳性细胞表达出现极显著升高，针药、电针及西药组IFN-γ表达则不同程度的降低，其中针药组表达接近于正常组水平；而IL-12表达针药、电针及西药组均较模型组有极显著降低；相反，Th2型细胞因子IL-4、IL-10免疫阳性细胞表达，各组间无显著差异，但均较正常组有极显著性升高。结论：UC结肠黏膜Th1细胞亚群优势活化所导致的Th1/Th2细胞亚群失衡是溃疡性结肠炎的发病机制之一。而针药结合可能通过有效抑制UC结肠黏膜Th1型细胞因子的表达，纠正Th细胞亚群间的失衡而达到其治疗目的。 关键词：溃疡性结肠炎；SD大鼠；IFN-γ；IL-12；IL-4；IL-10；针药结合 中图分类号：R-33 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)03-0544-03 溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)发病机制不明，其发病与遗传易感性、环境激发因素和免疫功能异常有关。研究表明UC结肠黏膜存在免疫异常，其中Th1与Th2细胞亚群间的失衡或Th1型细胞因子与Th2型细胞因子间的相互作用失调，在溃疡性结肠炎的免疫发病机制中起着重要作用。本课题组治疗UC取得良好的疗效，发现针灸治疗UC的作用机制与其调节异常的免疫功能有关[1-3]。为进一步探讨UC的免疫学发病机制，笔者在成功制备实验性UC大鼠模型的基础上，采用针药结合治疗观察对UC大鼠结肠黏膜组织Th细胞亚群调节机制的影响，以期为UC治疗提供实验资料。 1 材料与方法 1.1 动物与分组 雄性清洁级SD大鼠50只，体重(200±20)g，由上海中医药大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为正常组(10只)，模型组(10只)，电针组(10只)，西药组(10只)，电针加西药组(简称针药组，10只)。 1.2 模型制备 参照《药理实验方法学》[4]采用免疫学方法，并加局部刺激制备成实验性溃疡性结肠炎大鼠模型。采用溃疡性结肠炎患者术后新鲜结肠黏膜，加适量生理盐水制成黏膜匀浆，冷冻24h，溶冻后以3000r/min离心30min，取上清液提纯测定蛋白质含量，并与Freund佐剂混合配成乳剂。模型组大鼠首次每只足趾内注射抗原3mg，并在第10、17、24、31天分别于足趾、背部、腹股沟、腹腔内注射抗原6mg(末次注射不加Freund佐剂)，至血清抗结肠抗体达到一定效价，对模型大鼠2%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉，用3%福尔马林2mL灌肠，留置1h，以生理盐水洗净后排出，再用抗原液(4g/L不加佐剂)2mL灌肠，留置2h，洗净排去。正常SD大鼠为正常组，用生理盐水作与模型组相同处理。 1.3 治疗方法 在确定UC大鼠模型制备成功的基础上，进行分组治疗与观察。电针组：取穴：足三里(双)(穴位定位参照林文注《实验针灸学》[5])，接G6805Ⅱ型电针仪，连续波，频率2Hz，电流强度4mA，20min/次，1次/天，连续治疗10天。西药组：SASP溶液灌胃，每日投药量按成人(70kg体重)与大鼠(200g体重)1∶0.018比例(据《药理实验方法学》[4])配制SASP溶液，2次/天，3mL/次，连续灌胃10天。针药组：电针组+西药组，连续治疗10天。模型组：不作任何治疗，只作与治疗组相同的固定。正常对照组：选正常SD大鼠不作任何治疗，只作与治疗组相同的固定。 1.4 检测方法 1.4.1 试剂 IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；Envision试剂(R)和(M)购自DaKo公司；柠檬酸、无水乙醇、二甲苯均为国产分析纯。 1.4.2 免疫组化检测 于治疗结束后统一处死动物，迅速剖取结肠，用生理盐水冲洗后置于10%福尔马林液中固定，取与肠径垂直结肠组织常规脱水，透明，石蜡包埋和切片，然后将4μm石蜡切片贴在涂有切片粘合剂的载玻片上，58℃烤24h，常规脱蜡至水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10min，无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各2min，水洗。0.01mol/L pH7.4PBS洗3×3min，1%H2O2作用20min，PBS洗3×3min，抗原修复10min×2，自然冷却至室温，将