骨愈1号药物血清对成骨细胞增殖分化功能影响.docVIP

骨愈1号药物血清对成骨细胞增殖分化功能影响摘　要：目的：观察中药骨愈1号药物血清对成骨细胞增殖、分化以及矿化的影响。方法：从新生SD大鼠颅骨获取成骨细胞进行培养，取第3代成骨细胞进行试验，将其分为4组，在各组培养液中分别加入不灌胃骨愈1号的新西兰兔血清(对照组)和灌胃骨愈l号浓度分别12.5、25、50g/kg的新西兰兔血清(高、中、低剂量组)。用MTT法测定细胞增殖功能；用对硝基苯基磷酸二钠法测定碱性磷酸酶(ALP)活性；用茜素红染色法，在40倍光镜下作矿化结节计数。结果：与对照组比较，骨愈l号药物血清高、中、低剂量组在MTT显色的OD值、ALP活性和矿化结节数均明显升高(P＜0.01或者P＜0.05)。且高剂量组优于低剂量组(P＜0.01或者P＜0.05)。在提高ALP活性方面，高剂量组优于中剂量组(P＜0.05)。结论：骨愈1号具有促进成骨细胞增殖、分化及矿化作用。且其作用呈剂量相关性。 关键词：骨愈1号；成骨细胞；药物血清学 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)07-1408-02 骨折为骨科常见病，传统治疗方法需手术治疗，操作复杂，愈合时间长，骨愈1号方为本院骨科治疗骨折的临床经验方，初步观察表明该方能够缓解患者骨折后的临床症状。促进骨折愈合。为进一步验证该药促进骨折愈合作用并探讨其作用机理，本研究采用药物血清学的方法，观察不同浓度的骨愈1号方药物血清对成骨细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)、矿化结节的影响，现报道如下。 1 材　料 1．1 主要试剂新生牛血清(杭州四季青公司提供)、RP-M11640培养液(美国Gibeo公司提供)、胰酶、四甲基偶氮唑溢(MTT试剂)及Ⅱ型胶原酶(Sigma公司提供)；ALP放免试剂盒(北京中生公司提供)。 1．2 主要仪器，倒置显傲镜(Olympus公司提供)、细胞培养板(美国Gibco公司提供)、血球计数板、723型分光光度计、二氧化碳培养箱、ELX808酶标仪(Bio－Tek)等。 1．3 实验动物新生SD大鼠5只，用于提取成骨细胞：新西兰兔24只，雌雄各半，用于提取药物血清。均由河北医科大学实验动物中心提供。 1．4 实验药物骨愈1号方由党参、黄芪、桃仁、丹参、乳香、没药、三七、自然铜、骨碎补、川续断、杜仲、熟地等组成。 2 方　法 2．1 骨愈1号方药物血清的制备取新西兰兔24只，平均分为4组，每组6只，其中对照组不灌胃药物，低剂量组每日灌胃骨愈1号方12.5g/kg，中剂量组每日灌胃骨愈1号方25g/kg，高剂量组灌胃骨愈1号方50g/kg，每日1次，于第3日灌胃8h后抽取血液10mL，离心提取血清2mL，将每组6只新西兰兔的血清混合，经56℃水浴30min灭活后，用0.45μm的微孔滤膜过滤除菌，分装，置－80℃保存备用。 2．2 成骨细胞的分离及培养新生SD大鼠麻醉后，无菌取颅骨，剔除黏附的结缔组织和血管，剪碎，加0.2％I型胶原酶和0.1％透明质酸酶消化，消化5个循环，20min/次，收集第3、4、5次消化的细胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀的细胞用10％胎牛血清DMEM培养基重悬，吹打均匀，接种至培养瓶，于37℃，5％CO2培养箱内培养每2－3天换液1次，待细胞长满后进行传代，使用第3代细胞进行实验。 2．3实验方法取细胞铺满单层的24孔培养板，吸弃原培养液，用D－Hanks液洗1次，每孔加入1640液1mL，再按组别分别加入5％不同灌胃剂量的药物血清，其中药物血清组3组，另设对照组(未灌药家兔血清)1组，共4组，每组取8孔(n=8)细胞予实验。培养3h后检测指标。 2．4指标检测①细胞增殖功能测定：采用MTY法。每孔加入MTT(终浓度为0.5mg/mL)，继续培养3h，吸去培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)500μL，待孔内颗粒完全溶解后，移入96孔培养板内用酶标仪(λ=570nm)测定其光密度值(OD)，在酶标仪上进行测试分析。②细胞分化功能测定：以对硝基苯基磷酸二钠作底物，用分光光度计测定细胞溶液中的碱性磷酸酶(ALP)活性(条件为pH0.5，37℃条件下，波长为405nm)，再用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量(mg/L)，ALP比活性以kU/g蛋白表示。③细胞矿化功能测定：取培养的原代成骨细胞，接种于24孔培养板上连续观察14天，待形成大量的矿化结节后，再用0.1％茜素红染色30min。以橘红色结节、边界清晰、直径＞200μm为矿化结节的计数标准。在40光镜下对各孔作矿化结节计数(矿化结节结数/视野)。 2．5 统计学处理数据处理运用SPSS for Windows13.0统计软件，各组间比较采用单因素方差分析