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骨折三期治疗对骨生长因子TGF-β1表达影响实验探究关键词 中药 骨折 治疗 分期 骨形态发生蛋白 免疫组织化学? doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2009.07.001 骨折三期治疗是中医药治疗骨折的指导原则［1-3］，但是对其作用及其机制缺乏研究，甚至有学者对其作用提出疑义，认为没有分期治疗的必要性。随着分子生物学的发展，已阐明骨折愈合主要受局部骨生长因子的调控［4］，其中TGF-β1是关键的骨生长因子之一，对骨折愈合具有重要的调节作用。从分子生物学水平探讨中医骨折三期治疗对骨折愈合过程中骨折局部TGF-β1表达的影响进行研究。 材料与方法 实验动物：SD大鼠，北京市实验动物中心提供，SPF级。雄性，健康，体重270 ±20g。动物实验室: 中国中医科学院动物室（二级）。实验用中药 :同仁堂医药公司崇文门分公司提供。 手术器械：上海医疗器械厂生产。石蜡切片机：Reichert-Jung Histocut 820-Ⅱ,West-Germany。生物组织自动脱水机：TS-12F，中国湖北省孝感市。光学显微镜:Olimpus Vanox型,Olimpus Com .Japan。彩色图像分析仪：Mis-2000SP，Microimage Analysis System，USA 3Y-international Co.LTD，连接装有Polaroid MDC Nikon的显微镜。图像分析软件：Pixelpro，Ver.4.0。 多聚甲醛：北京市化学试剂公司；批号：990106,Q/H82-0006-94。 EDTA-Na?2：北京市化学试剂公司；批号：960923,GB1401-78。S-P免疫组化染色试剂盒：北京中山生物技术有限公司提供，S-P 9001；批号兔bFGF多克隆抗体：Santa Cruz Biotechnology,Inc，北京中山生物技术有限公司提供；批号：D0203。 建立骨折模型：麻醉后造成胫骨上1/3段中点造成宽2mm、深1.5mm骨质缺损。 随机分组：将168只SD大鼠应用随机数字表随机的方法随机取6只作为正常对照组，其余造模后平均分为三期治疗组、一期治疗组与模型对照组，每组再按随机数字表随机的方法平均分为9个小组，每小组6只。 干预方法：①基本方剂组成：本实验三期治疗组所用方剂是基于高等中医药院校统编教材《中医正骨学》中的肢伤一方、二方及三方［1］。②给药方法：按传统方法制成水煎剂，含生药1.5g/ml， 2倍等效剂量为实验用药剂量。分早晚2次，灌胃。③SD大鼠骨折分期：根据骨折愈合分期方法与SD大鼠骨折局部组织学变化，将骨折愈合过程分为三期：早期，即血肿机化演进期，骨折后1～3天；中期，即原始骨痂形成期，骨折后4～14天；后期，即改造塑形期，骨折后15天以后。④三期治疗组：根据“中医骨折三期治疗”原则，分3期治疗：早期：活血化瘀、行气止痛，选用加减肢伤一方；中期：接骨续筋、舒筋活络，选用加减肢伤二方；后期：补益肝肾、强筋壮骨，选用加减肢伤三方。⑤一期治疗组：将骨折的早期、中期与后期合并为一期，活血化瘀、行气止痛、接骨续筋、补益肝肾、强筋壮骨，选用加减肢伤一方、二方与三方的综合方治疗。⑥模型对照组：给予和实验组等量的生理盐水，灌胃，每日2次。⑦标本处理：分别于造模后1、3、5、7、9、12、15、18、21及28天，以断髓法每组各处死1小组大鼠，取出胫骨，固定，脱钙，切片，切片以HE染色和以TGF-β1免疫组化染色进行组织学和免疫组织化学检测。 TGF-β1免疫组织化学检测：①免疫组织化学染色(S-P法)：石蜡切片常规脱蜡至水。滴加3%H2O2，37℃，孵育15分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水洗涤3次，每次5分钟。PBS洗涤3次，每次3分钟。滴加正常羊血清，37℃，孵育15分钟，以封闭非特异性染色。滴加一抗(兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体工作浓度为1:30)，37℃，孵育120分钟。PBS洗涤3次，每次3分钟。滴加生物素标记羊抗兔IgG，37℃，孵育15分钟。PBS洗涤3次，每次3分钟。滴加辣根酶标记链霉卵白素(S-A/HRP)，37℃，孵育15分钟。PBS洗涤3次，每次3分钟。滴加显色剂DAB-H?2O?2液，显色15分钟。蒸馏水洗涤，终止显色反应。常规梯度脱水、透明、加拿大中性树脂封片。同时用1组织标本，以PBS代替一抗，作为阴性对照。②结果判断细胞浆被染成棕黄色为TGF-β1表达阳性，未显棕色者为阴性。 图像分析：①图像选取位置的确定：于骨折间隙内，分别于两骨折断端平齐原骨皮质的内、外缘，各取1视野，然后于骨折间隙的中心向两侧骨折断端方向各取1视野，共6个视野。②图像采集条件：显微