黄芪注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠MMP-9及IL-1β影响.docVIP

黄芪注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠MMP-9及IL-1β影响摘要 目的：观察黄芪注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠MMP-9及IL-1β的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤保护作用的机制。方法：采用大脑中动脉局灶性栓塞（MCAO）模型，干湿比重法检测脑含量，免疫组化法检测脑组织MMP-9的表达，ELISA法检测脑组织IL-1β的含量。结果：与模型组相比，黄芪注射液可显著降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织MMP-9和IL-1β的表达及含水量。结论：黄芪注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠有明显的抗炎和减轻水肿的保护作用。 关键词 脑缺血再灌注 黄芪注射液 脑水肿 MMP-9 IL-1β 大鼠 脑缺血后脑组织发生水肿，其发生机制还没有完全被解读，而脑缺血后炎性反应在脑水肿中扮演的角色越来越受到人们的重视。黄芪具有补气益气功效,已经广泛应用到脑缺血患者的治疗中。主要是因为它具有有通脉作用，但其在降低炎性反应，减轻脑水肿中的作用研究较少。故本实验主要研究黄芪注射液在脑缺血再灌注损伤的抗炎作用及其对脑水肿的影响。实验主要检测脑组织基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及白介素-1β（IL-1β）表达和脑含水量的变化，探索黄芪注射液对脑缺血再灌注损伤的保护机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物：均为健康清洁级SD大鼠，雄性，每组10只，体重280±10g，购自动物实验中心，动物实验合格证：SYXK（浙）2008-0115。术前禁食不禁水12h。 1.2 试剂与仪器：黄芪注射液：成都地奥九泓制药厂，批号：0809032。TU-1900双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。兔抗鼠MMP-9抗体、过氧化物酶标记的羊抗兔IgG：武汉博士德公司。大鼠IL-1β Beta ELLSA试剂盒：北京富众科技发展有限公司。 1.3 模型制备：大鼠称重后用10%水合氯醛（0.4ml/100g体重）腹腔麻醉,按照Ludmila Belayev［1］的方法，在颈正中切开并暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉及其分支，结扎并剪断颈外动脉。用动脉夹暂时阻断颈总动脉，在距颈总动脉分叉0.8~1.0cm处用双重丝线结扎颈外动脉，在颈外动脉近心端将多聚赖氨酸处理的4-0(直径0.26mm)尼龙线从小口经分叉处轻轻推入颈内动脉，当插入距颈总动脉分叉约2.0cm处并有轻微阻力，表明已阻塞了大脑中动脉主干的起始部。随后在颈外动脉插入的近心端用丝线结扎。假手术组尼龙线只插入0.5cm左右。经60min缺血后，将尼龙线抽出，扎紧切口，松开颈总动脉的动脉夹，行再灌注。手术过程保持大鼠肛温在37～38℃，并维持至动物麻醉苏醒。模型成功标志：①提尾时左前肢内收屈曲;②同侧Homer征(即同侧眼球下陷,眼裂变小);③爬行时向左侧转圈。不符合标准的动物剔除。 1.4 分组与给药：将30只SD大鼠随机分为3组，即假手术组、模型组、黄芪组。黄芪组于造模后第二天开始腹腔注射黄芪注射液（5.0ml/kg），连续3d，假手术组、模型组按同样方法腹腔注射等量生理盐水。 1.5 检测指标与方法：分述如下。 1.5.1 脑含水量测定：于第3d行为学评价结束后用10%水合氯醛（0.4ml/100g体重）腹腔注射麻醉,心脏灌流后，断头取脑，低温下取血肿中心前半分区脑组织,准确称重置于(100～110)℃的烤箱中烘24h至恒重后,称取干重,根据公式:脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重来计算,精确度为0.01。 1.5.2 MMP-9的表达：同上法低温下取出脑组织靠枕叶的1/2脑组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，用于免疫组化测定MMP-9表达。 1.5.3 IL-1β的表达：同上法低温下取出脑组织靠枕叶的1/2脑组织，称重后按重量体积比加生理盐水制备成10%的组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清，-80℃冰箱保存待用。脑组织中IL-1β测定用ELSA法。分别按照各试剂盒说明书操作。 1.6 数据处理：数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS11.5统计软件one-way ANOVA进行方差分析。 2 结果 2.1 脑含水量变化：详见表1。假手术组与模型组比较，模型组脑组织含水量明显升高，有统计学差异（P0.01）。黄芪组与假手术组比较，脑组织含水量明显增加，有统计学差异（P0.05）；与模型组比较，脑组织含水量出现降低，有统计学差异（P0.05）。 2.2 脑组织MMP-9表达变化：见表2。假手术组大鼠脑组织MMP-9阳性细胞表达极少，模型组表达明显增加，两者有统计学差异（P0.01）。黄芪组表达增多，与假手术组比较明显增加，两者有统计学差异（P0.01）；与模型组比较黄芪组大鼠脑组织MMP-9